1、中重度以上急性放射病(acuteradiationsickness,ARS)患者常因造血衰竭、免疫功能低下繼發(fā)嚴重感染、臟器輻射損傷所致多臟器衰竭而死亡。由于造血干細胞移植技術的完善以及細胞因子的廣泛應用,使放射病患者造血功能恢復成為可能;但免疫功能低下和多臟器衰竭仍然是危及這類患者生命的主要因素。胸腺是中樞免疫器官,由骨髓遷入的淋巴祖細胞在這里分化、發(fā)育成為成熟的T細胞后輸出到外周淋巴組織,対機體免疫功能的維持和調節(jié)起著不可低估的作用

2、。但胸腺也是對輻射高度敏感的器官,在中重度以上ARS發(fā)生時常被累及而影響機體的免疫功能。因此,及時修復損傷的胸腺能有效改善放射病患者的免疫功能。骨髓間充質干細胞(Mesenchymalstemcells,MSC)來源于中胚層,可橫向或跨胚層向多種組織分化,參與損傷組織臟器的修復;同時,MSC還能維持胸腺基質微環(huán)境,與胸腺上皮細胞協(xié)同作用,促進T細胞成熟。能否用MSC修復放射損傷的胸腺、恢復機體的免疫功能,目前相關的報道不多,本實驗將就這

3、一問題進行研究。
　　目的
　　本實驗利用60Coγ射線照射后建立的胸腺放射性損傷小鼠模型,研究增強型綠色熒光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因修飾的MSC対胸腺放射損傷的修復作用和機制,為中重度以上ARS的救治探索新的途徑。
　　方法
　　1.用全骨髓細胞貼壁法分離純化雄性C57小鼠骨髓MSC,并改良培養(yǎng)條件,體外培養(yǎng)、擴增、傳代,待細胞傳至第二代,通過細胞形態(tài)

4、、細胞表型和成骨、成脂實驗,來驗證所獲細胞是否為實驗需要的MSC。
　　2.通過腺病毒轉染技術,用含有報告基因EGFP的穿梭質粒和pAdxsi載體構建重組腺病毒載體質粒,轉染H293細胞并擴增,構建表達EGFP的重組腺病毒(pAdxsi-EGFP),純化后以TCID50法(50％tissuecultureinfectivedose)測定病毒滴度。然后將構建的重組腺病毒以0、50、150、300四種感染復數(shù)(Multiplicity

5、ofinfection,MOI)感染鑒定正確的MSC,用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測感染率,確定最佳MOI,并以CCK-8(Cellcountingkit-8)法檢測感染后MSC的增殖活性。
　　3.以不同劑量60Coγ射線照射雌性BALB/C小鼠制作胸腺放射性損傷模型。以6Gy、9Gy、12Gy三個劑量經前胸野單次照射小鼠縱膈,其余部位以10cm鉛板遮蔽,劑量率為154.7cGy/min,動物距放射源80cm,照射時長分別為6Gy

6、:257秒;9Gy:386秒;12Gy:514秒。照射后觀察小鼠體重、進食水量、胸腺指數(shù)、胸腺病理、食管、氣管、肺的病理、外周血像、胸腺T亞群和外周血T亞群變化,判斷模型是否構建成功,并選擇最佳照射劑量,然后以此劑量照射小鼠構建胸腺放射損傷模型。
　　4.用構建的基因修飾MSC經尾靜脈輸注到胸腺放射性損傷模型小鼠體內,觀察小鼠體重、胸腺指數(shù)、胸腺病理、外周血像、胸腺T亞群和外周血T亞群、胸腺T細胞重排刪除環(huán)(Tcellrecept

7、orrearrangementexcisioncircles,TREC)、外周血細胞因子的變化以及胸腺Y染色體性別決定區(qū)(Sex-determiningRegionofY-chromosome,Sry)的表達情況,判斷MSC対胸腺放射性損傷的修復及對機體免疫功能恢復的作用和機制。
　　結果
　　1.在倒置顯微鏡下觀察,體外分離培養(yǎng)的MSC在接種24小時后開始貼壁,起初形狀多為小圓形及多角形,培養(yǎng)至第7天多數(shù)細胞伸展呈梭形并呈

8、集落式生長,傳代培養(yǎng)至第2代時細胞形態(tài)趨于統(tǒng)一,呈現(xiàn)為長梭形細胞束裝排列。流式細胞儀檢測第二代MSC細胞表型,高表達CD105(69.01%)、CD44(95.65%),低表達CD34(0.76%)、CD45(5.37%)。成骨誘導3周后以VonKossa染色,可見染色陽性的骨結節(jié);成脂誘導后2周可見油紅O染色的紅色脂肪細胞。
　　2.將重組穿梭載體質粒pAdxsi-EGFP用XhoI酶切后,1%瓊脂糖凝膠電泳可見7條大小分別為1

9、4K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K條帶,而單純pAdxsi經XhoI酶切、電泳后僅有14kb,11.8kb,4.0kb,2.47kb,1.45kb,0.6kb6條帶。然后在H293細胞中擴增、純化后以TCID50法測定病毒滴度為2×1010pfu/ml。用構建的重組腺病毒感染MSC,感染后10小時可見綠色熒光表達,隨時間推移逐漸增強,第7天后表達率達最高并趨于穩(wěn)定,體外培養(yǎng)28天仍可見熒光;且感

10、染率隨MOI的增加而增加,但MOI為300時細胞形態(tài)變化較明顯,表現(xiàn)為較多細胞變形、漂浮,提示細胞受損,MOI為150時,感染率較高,且細胞形態(tài)變化不大。經流式細胞儀檢測四組感染率分別為7.4%、65.7%、92.3%、94.6%。以MOI150感染MSC后,與未感染MSC相比,CCK-8法檢測兩者增殖活性無差異(P﹥0.05)。
　　3.三個劑量照射組在照射后各個時間點體重均低于對照組,但6Gy照射組僅在第14天與對照組相比有差

11、異(P<0.05),9Gy照射組在照后第14、21天與對照組相比有差異(P<0.05),而12Gy照射組在照射后第14、21、28天與對照組有差異(P<0.05)。照射后1周內平均每日進食量和飲水量,6Gy及9Gy兩組與對照組無差異(P>0.05),12Gy組與對照組相比有差異(P<0.05)。三個劑量照射組在照后各個時間點胸腺指數(shù)均低于對照組;6Gy組在照后第14、21、28天與對照組相比有差異(P<0.05);9Gy與12Gy照射組

12、在照后第7、14、21、28天與對照組相比有差異(P<0.05),其中第21、28天差異更顯著(P<0.01)。病理組織學顯示照射組小鼠胸腺萎縮,皮質區(qū)淋巴細胞變性壞死,出現(xiàn)較多細胞碎片,髓質區(qū)胸腺小體消失,細胞數(shù)量減少,尤以照射后第7天較明顯,且損傷程度與放射劑量呈正相關;照射后第14天,胸腺細胞數(shù)量逐漸增加,胸腺體積逐漸增大,但照射后28天仍未恢復正常。12Gy照射組部分小鼠食管、氣管病理顯示黏膜基底層細胞增多,血管充血,上皮層部分

13、壞死脫落,固有層、黏膜下層可見炎細胞浸潤;其余兩組食管、氣管、肺病理未出現(xiàn)放射損傷。三個劑量照射組外周血白細胞計數(shù)和淋巴細胞計數(shù)在照射后低于對照組,照射后第7天降到最低,其后逐步升高,但至照射后28天仍未完全恢復正常,在照射后各個時間點上與對照組相比有顯著性差異(P<0.01);6Gy與9Gy兩組無差異,12Gy組在照后第7天和第14天與6Gy、9Gy兩組比有差異(P<0.05)。對照組胸腺CD4+CD8+細胞比例大約70%,CD4+C

14、D8-細胞比例約為20%,CD4-CD8+細胞比例約為7%,而CD4-CD8-細胞僅占2%左右。照射后,CD4+CD8+細胞下降幅度最大,最低可降至照射前的十分之一,照射后第14天,比例逐漸恢復,但至照后28天也未恢復到照射前水平。CD4-CD8-細胞則于照后出現(xiàn)大幅度升高,在照射后第7天升至最高,幅度最大者接近60倍,其后逐步回落,但至照后28天也明顯高于照射前水平。CD4+CD8-和CD4-CD8+細胞比例在照射后出現(xiàn)下降,在照射后

15、第14天降至最低,然后逐漸回升。對照組外周血中CD3+細胞比例在40%左右,CD3+CD4+細胞比例約為30%,而CD3+CD8+細胞比例約為10%,CD4/CD8約為3.0。照射后第1天,照射組各群細胞的比例短暫升高后下降,在照射后第14天,CD3+細胞比例回升,其后再次緩慢下降;CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞的比例和CD4/CD8的值則持續(xù)下降,但從第14天起,下降的幅度明顯減小。三個照射組的胸腺和外周血T亞群變化趨勢相同,

16、但隨著照射劑量的增大,各亞群的變化幅度增大。
　　4.對照組和對照+MSC組在各指標上無差異(P>0.05)。照射組與照射+MSC組除了Sry檢測結果外,其余各指標變化趨勢一致(變化趨勢見結果3),但照射+MSC組要優(yōu)于照射組,且兩者差異有統(tǒng)計學意義;同時照射+MSC組與對照組也有差異。熒光病理顯示輸注MSC后1天胸腺出現(xiàn)綠色熒光,但僅在血管周圍表達,隨著時間的推移,熒光逐漸彌漫至整個組織,在第7天表達達高峰,其后逐漸減少,至35

17、天基本消失。照射+MSC組IFN-γ、TGF-β血清含量明顯增高,與照射組及對照組比較差異有統(tǒng)計學意義,IL-4濃度與照射及對照組無差異。Sry檢測除照射+MSC組在照射后14及28天為陽性外,其余各組均為陰性。
　　結論
　　1.用全骨髓細胞貼壁法并改良培養(yǎng)條件后培養(yǎng)的細胞從形態(tài)、細胞表型及多向分化能力三個方面鑒定,是實驗所需的骨髓間充質干細胞。
　　2.用構建的重組腺病毒以最佳MOI為150感染MSC后,MSC能穩(wěn)

18、定、高效表達EGFP,并且不影響細胞的增殖活性,通過腺病毒為載體導入外源基因可成功獲取基因修飾的MSC。
　　3.6Gy、9Gy、12Gy三個劑量均可引起小鼠胸腺的放射性損傷,但9Gy照射后胸腺改變較典型,且無其它臟器損傷,用此劑量單次照射小鼠縱膈可成功構建小鼠胸腺放射性損傷模型。
　　4.用基因修飾的MSC治療胸腺放射損傷小鼠模型,MSC可歸巢至胸腺并增殖,參與胸腺的修復,減輕胸腺的輻射損傷,并能有效恢復機體受損的免疫功能