1、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌是臨床分離率占前四位的革蘭陰性桿菌。碳青霉烯類抗生素耐藥革蘭陰性桿菌的出現(xiàn)和流行，給臨床抗感染治療和醫(yī)院內(nèi)感染控制帶來了極大困難?；诜肿臃中图夹g(shù)的分子流行病學(xué)研究可明確菌株的流行情況和變化趨勢，為感染防控措施的制定提供科學(xué)依據(jù);革蘭陰性菌碳青霉烯類耐藥決定子的快速檢測可為臨床感染性疾病的診治爭取寶貴時間。
　　本研究首先對近年來我院出現(xiàn)的碳青霉烯類耐藥的重要革蘭陰性桿菌的流行情

2、況、耐藥機制及歷年來的變遷進行調(diào)查。受試菌株包括2009年-2012年浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院分離的碳青霉烯類耐藥或敏感性降低的16株大腸埃希菌、87株肺炎克雷伯菌、80株鮑曼不動桿菌和67株銅綠假單胞菌。藥物敏感性試驗顯示多黏菌素B和黏菌素對碳青霉烯類耐藥菌株具有強大的抗菌活性，其次為阿米卡星。產(chǎn)碳青霉烯酶是革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類耐藥的主要原因。大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌所產(chǎn)碳青霉烯酶以KPC-2為主，鮑曼不動桿菌主要

3、產(chǎn)OXA-23型碳青霉烯酶。對碳青霉烯類耐藥菌株進行脈沖場凝膠電泳(PFGE)分析發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌的醫(yī)院內(nèi)克隆傳播較為嚴重。肺炎克雷伯菌從2009年到2012年期間，一直存在KP-A型優(yōu)勢克隆株縱向傳播現(xiàn)象;銅綠假單胞菌的克隆傳播現(xiàn)象不明顯，但自2010年以來，PA-A型克隆株一直在我院傳播。鮑曼不動桿菌各年份內(nèi)橫向傳播現(xiàn)象較嚴重，而各年份之間沒有同一優(yōu)勢克隆株。多位點序列分型(MLST)顯示，ST131和ST11分別是大

4、腸埃希菌和肺炎克雷伯菌主要的ST型;銅綠假單胞菌以ST463最為常見;鮑曼不動桿菌的ST型分布較為分散，但幾個主要的ST型均屬于克隆復(fù)合群208(CC208)。除了產(chǎn)碳青霉烯酶，高產(chǎn)ESBLs或AmpC酶合并膜孔蛋白缺失是導(dǎo)致腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥的另一主要原因。
　　以上述結(jié)果為基礎(chǔ)，本研究采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)建立了可快速、準確地檢測革蘭陰性桿菌碳青霉烯耐藥決定子

5、的方法。用MALDI-TOF MS對50株革蘭陰性桿菌進行碳青霉烯酶檢測，整個過程僅需2小時左右，且操作簡便，試劑成本非常低，適合大樣本量檢測。提取10株大腸埃希菌和8株肺炎克雷伯菌的外膜蛋白用MALDI-TOF MS檢測，肺炎克雷伯菌主要缺失質(zhì)荷比為37，000和38，000的質(zhì)譜峰，大腸埃希菌同樣主要缺失這兩個質(zhì)譜峰。與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)相比，大腸埃希菌外膜蛋白MALDI-TOF MS缺失的37，

6、000-和38，000-m/z的質(zhì)譜峰分別對應(yīng)SDS-PAGE的40kDa和41kDa條帶;肺炎克雷伯菌外膜蛋白MALDI-TOF MS缺失的38，000-m/z的質(zhì)譜峰對應(yīng)SDS-PAGE的42kDa條帶，37kDa的質(zhì)譜峰在SDS-PAGE上未顯示;為了驗證MALDI-TOF MS所缺失質(zhì)譜峰與SDS-PAGE所缺失條帶的關(guān)系，我們對SDS-PAGE膠上的目的條帶進行胰酶水解，并用MALDI-TOF/TOF MS進行分析及數(shù)據(jù)庫比對

7、，結(jié)果證明大腸埃希菌外膜蛋白MALDI-TOF MS所缺失的37，000-和38，000-m/z質(zhì)譜峰分別對應(yīng)SDS-PAGE上的40kDa的OmpF和41kDa的OmpC，肺炎克雷伯菌外膜蛋白MALDI-TOF MS所缺失的38，600-m/z質(zhì)譜峰對應(yīng)SDS-PAGE上的42kDa的OmpK36。與SDS-PAGE相比，MALDI-TOF MS具有操作簡便，耗時短，分辨率高，影響因素少，結(jié)果易于觀察等優(yōu)點。
　　綜上所述，碳青