1、背景與目的:
　　中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHINET)從2005年到2013年連續(xù)八年對(duì)全國各地臨床分離菌株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，分析結(jié)果表明，革蘭陰性桿菌為我國大型教學(xué)醫(yī)院主要的臨床分離菌株（約占70％），分離率有升高趨勢(shì)，從2005年為66.9%至2010年的71.6%，在2013年升至73.0%。其中腸桿菌科耐碳青霉烯藥物比例從2005年0%～3%升至2013年的7%，非發(fā)酵菌耐碳青霉烯藥物比例從2005年30%升至2013年的60

2、%。革蘭陰性菌中最常見的菌株分別為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌。二十世紀(jì)八十年代以來，由于廣譜抗菌藥物的濫用，革蘭陰性桿菌的耐藥狀況日趨嚴(yán)重?；谔记嗝瓜╊愃幬飳?duì)革蘭陰性桿菌具有穩(wěn)定的抗菌效果，臨床將其作為對(duì)革蘭陰性桿菌感染治療的重要手段。然而，近年來，對(duì)碳青霉烯藥物耐藥細(xì)菌的報(bào)道越來越多。因此，加強(qiáng)對(duì)此類細(xì)菌耐藥性的研究、監(jiān)測(cè)、遏制耐碳青霉烯類藥物菌株的產(chǎn)生與傳播，成為微生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　耐碳青霉

3、烯類藥物革蘭陰性桿菌常常為多重耐藥/泛耐藥菌株，攜帶并有效表達(dá)耐藥基因，是此類菌株產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制，產(chǎn)生水解酶，通道蛋白改變，外排泵過表達(dá)，青霉素結(jié)合蛋白改變等，是細(xì)菌對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵機(jī)制。目前用于治療此類菌株感染的抗菌藥物主要為β內(nèi)酰胺類藥物，包括青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類藥物等。菌株對(duì)這些藥物的耐藥常常涉及一種或多種機(jī)制。鑒于臨床治療實(shí)際需要及檢測(cè)試驗(yàn)可操作性等原因，明確此類菌株的耐藥表型，是當(dāng)前研究的主要內(nèi)容之一。根

4、據(jù)體外藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果，分析臨床分離菌株對(duì)各類藥物的耐藥特征，可有效反映分離菌株耐藥性的地域性差異，對(duì)于指導(dǎo)當(dāng)?shù)嘏R床醫(yī)生合理抗菌治療具有重要的實(shí)踐價(jià)值。
　　對(duì)于碳青霉烯類藥物而言，產(chǎn)生碳青霉烯酶是細(xì)菌耐藥的主要機(jī)制。目前，國內(nèi)外針對(duì)此類菌株的研究，多著力于碳青霉烯酶在不同菌株中的分布差異，以及在不同地域的流行分布特征。根據(jù)Ambler分子結(jié)構(gòu)分類，可將碳青霉烯酶分為3組，分別為A、B、D三類酶，A類、D類為絲氨酸酶，B類為金屬b

5、eta內(nèi)酰胺酶。B類酶中又以NDM-1型酶最為常見，在世界多個(gè)國家和地區(qū)均有報(bào)道，并且blaNDM的變異基因正在逐漸發(fā)現(xiàn)并報(bào)道（包括NDM-1到NDM-14）。研究表明，亞型之間雖然僅有個(gè)別氨基酸的置換，但其耐藥性有所不同。此外，從生物信息學(xué)的角度來看，不同型別的碳青霉烯酶受到抗菌藥物長期作用，有著各自相對(duì)穩(wěn)定的進(jìn)化關(guān)系。明確本地區(qū)所流行碳青霉烯酶的種類，以及不同菌株中攜帶酶的類型差異，分析流行型別在進(jìn)化關(guān)系樹中的位置，預(yù)測(cè)其下一步可能

6、的突變進(jìn)化方向，對(duì)指導(dǎo)本地區(qū)抗感染治療，具有重要意義。
　　基于耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌的廣泛耐藥活性，此類菌株在院內(nèi)感染中占據(jù)著重要地位，而院內(nèi)感染又是此類菌株擴(kuò)散及其耐藥性在菌株間傳播的重要方式。因此，對(duì)臨床分離菌株進(jìn)行克隆株分型研究，明確是否存在耐碳青霉烯藥物菌株，以及該菌株是否有院內(nèi)感染流行趨勢(shì)，可為臨床經(jīng)驗(yàn)治療提供合理指導(dǎo)外，對(duì)于院內(nèi)感染的防控亦具有重要價(jià)值。
　　為解決上述問題，我們?cè)O(shè)計(jì)了本課題，旨在通過檢測(cè)臨床分

7、離耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌，分析其耐藥表型，探究碳青霉烯耐藥基因的存在與分布，明確是否有院內(nèi)感染的存在，為臨床抗感染治療及流行病學(xué)研究，提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法:
　?。?）菌株收集收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室2013年7月到2013年12月份間，臨床分離來自河南不同地區(qū)的不同標(biāo)本來源的耐亞胺培南/美羅培南非重復(fù)革蘭陰性桿菌121株，其中大腸埃希菌10株，肺炎克雷伯菌19株，銅綠假單胞菌30株和鮑曼不動(dòng)桿菌62

8、株所有菌株均經(jīng)過Vitek2 Compact鑒定到種。
　?。?）細(xì)菌耐藥性及流行病學(xué)分析采用WHOnet5.0分析軟件，對(duì)所有分離菌株流行分布特征及耐藥表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。藥物敏感試驗(yàn)質(zhì)控菌株采用大腸埃希菌ATCC25922。
　　（3）全基因組DNA采用DNA提取試劑盒提取。嚴(yán)格按照說明書要求規(guī)范操作。
　?。?）耐碳青霉烯菌株初篩首先用改良Hodge實(shí)驗(yàn)和EDTA協(xié)同抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)碳青霉烯酶進(jìn)行表型篩選，改良Hodge

9、實(shí)驗(yàn)以待測(cè)株和陽性對(duì)照株在抑菌圈與劃線交叉處有增強(qiáng)生長現(xiàn)象為篩選陽性。EDTA協(xié)同實(shí)驗(yàn)以靠近EDTA紙片處有抑菌環(huán)擴(kuò)大為陽性篩選。
　?。?）耐碳青霉烯菌株確證對(duì)于初篩陽性菌株，提取全基因組DNA后，采用PCR技術(shù)對(duì)A類（KPC）、B類（NDM，VIM，SPM，IMP，GIM）和D類酶基因（OXA23，OXA24，OXA51，OXA58）擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果Blast比對(duì)明確型別。
　?。?）分子進(jìn)化預(yù)測(cè)

10、分析NDM酶所有變異體結(jié)構(gòu)及氨基酸序列差異，使用軟件分析藥物正選擇位點(diǎn)并模擬變異體酶蛋白三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)行NDM變異體同源性分析。
　?。?）菌株分型研究采用RAPD-PCR方法對(duì)銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行隨機(jī)引物擴(kuò)增，依據(jù)擴(kuò)增結(jié)果對(duì)菌株進(jìn)行同源性分析。
　　結(jié)果:
　　1.碳青霉烯酶檢出情況
　　檢出A類KPC陽性11株，其中肺炎克雷伯菌10株，大腸埃希菌1株，檢出B類NDM陽性7株，其中肺炎克雷伯菌3株，大腸

11、埃希菌4株，其中有兩株檢測(cè)出NDM-5（國內(nèi)僅兩例報(bào)道）。對(duì)銅綠假單胞菌的碳青霉烯酶基因擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)D類酶基因擴(kuò)增，60株鮑曼均為OXA23，OXA51陽性，其中一株鮑曼不動(dòng)OXA24陽性，一株OXA58陽性。
　　2.金屬酶NDM變異體
　　本研究通過對(duì) PCR陽性標(biāo)本的測(cè)序中發(fā)現(xiàn)了blaNDM-5，發(fā)現(xiàn)時(shí)國內(nèi)尚無報(bào)道，僅在國際上有幾例報(bào)道。blaNDM-5相比于blaNDM-1為88位與154位發(fā)生

12、氨基酸置換。
　　3.菌株分型情況
　　根據(jù)RAPD-PCR菌株分型技術(shù)聯(lián)合瓊脂糖凝膠電泳，將銅綠假單胞菌分為14型，鮑曼不動(dòng)桿菌分為4型。
　　結(jié)論:
　?。?）腸桿菌科碳青霉烯酶基因分離率高，占62%，產(chǎn)生碳青霉烯酶是腸桿菌科耐碳青霉烯藥物的主要機(jī)制。其中在兩株大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)blaNDM-1變異基因blaNDM-5，并且耐藥性不同。耐藥基因通過單個(gè)核苷酸的突變產(chǎn)生新的耐藥基因型。
　　（2）在銅綠假單