1、糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂。并且往往合并動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)大血管并發(fā)癥。高血糖是糖尿病的標志，也是導致糖尿病慢性血管并發(fā)癥的主要因素。本研究通過觀察在不同葡萄糖濃度狀態(tài)下對培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞株凋亡，生存抑制率及形態(tài)學的改變，從基礎領域方面探討血糖漂移對血管內皮細胞的損害及引發(fā)動脈粥樣硬化機制。 2型糖尿病的血糖增高，特別是血糖波動對心血管內皮細胞的損害已被人們證實。

2、而血管內皮細胞并不只是血管內層的屏障，由于它具有分泌功能，所以已被認為是最大的內分泌器官。近年來研究發(fā)現(xiàn)基質金屬蛋白酶-9作為一種降解細胞外基質的蛋白酶，能促進動脈粥樣硬化(AS)斑塊的形成，發(fā)展及破裂，在AS病變時增高。在葡萄糖濃度波動狀態(tài)下MMP-9表達情況目前研究報告很少，故本研究通過培養(yǎng)內皮細胞和人髓系白血病單核細胞株THP-1在葡萄糖濃度波動狀態(tài)下應用分子生物學技術測定MMP-9 mRNA.表達及蛋白水平的變化，以探求葡萄糖濃

3、度漂移對對血管內皮細胞的MMP-9mRNA表達及蛋白量變化及其在2型糖尿病大血管病變中的作用。 實驗方法: 1、細胞培養(yǎng)和計數(shù) 血管內皮細胞株ECV304購自中國培養(yǎng)物典藏中心。將凍存的血管內皮細胞株ECV304盡快解凍。加入含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液10mL，混勻，1000轉/min離心5min，棄上清用培養(yǎng)基稀釋混勻，接種于培養(yǎng)瓶中，直至長滿并融合成單層。用0.125％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液1

4、:1消化，傳代比例為1:2，其他條件不變。取對數(shù)生長期細胞，計數(shù)細胞后調整細胞數(shù)分別接種于250ml，50ml培養(yǎng)瓶及6孔，96孔培養(yǎng)板中待細胞均勻鋪滿容器底面后，分組實驗。 2、實驗分組 將上述培養(yǎng)細胞更換含1％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，然后分四組：①5mmo l/L葡萄糖組;②20mmol/L甘露醇組；③20mmol/L葡萄糖組；④5mmo l/L葡萄糖和20mmo l/L葡萄糖每24小時交替培養(yǎng)組應用無血清培

5、養(yǎng)基37℃5％Co,孵箱中培養(yǎng)14天進行實驗。 3、MTT檢測細胞存活率 將96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的細胞每孔加入MTT溶液20μl37℃繼續(xù)孵育4小時，然后吸去孔內上清液，加入150μlDMSO振蕩10分鐘。選擇490nm波長在酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值。 4、細胞凋亡的檢測 應用異硫氫酸熒光素標記膜聯(lián)蛋白V(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)雙染法檢測細胞凋亡。PBS沖洗一次后，用1×結合

6、緩沖液懸浮細胞至1×106/ml，取100μl細胞(1×105)稀釋至5ml加入含5μl異硫氫酸熒光素標記膜聯(lián)蛋白V(Annexin V-FITC/PI)，10μl碘化丙啶(PI)混勻后，避光室溫孵育15min，每管加入400μl，1X結合緩沖液，并上機檢測。 5、吖啶橙(Ao)細胞熒光染色 取6孔培養(yǎng)板中蓋玻片上的已經分組按上述方法培養(yǎng)的細胞，PBS洗三次，95％乙醇固定20min,1％醋酸作用30sec，加入0.01

7、％AO染色5 min，PBS清洗1min，0.1mmol/L CaCl2分色2min，PBS清洗3次，甘油：PBS1:1封片，熒光顯微鏡下405nm濾光片立即觀察。 6、RT-PCR法檢測的mRNA表達 Trizol提取細胞總RNA，測OD260/OD28d，計算RNA濃度。取2μgRNA逆轉錄為cDNA，取cDNA2μl進行PCR擴增。反應體系為12.5μl，94℃預變性2min，94℃40sec，60℃40sec，7

8、2℃1min共35個循環(huán)，72℃終末延伸5min。取PCR產物5μl電泳分離后進行掃描分析，以β-actin條帶亮度值進行標準校正，計算其相對表達量。 7、TGF-βl(ELISA方法)含量檢測 從已平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，分別將標本(標準品)100μl/孔加入，封板膠紙封住反應孔，37℃孵箱孵育90min。洗板4次，甩凈孔內液體，每孔加洗滌液350μl，靜置30sec甩凈，在厚疊吸水紙上拍干。加入生物素化抗體

9、工作液封住反應孔37℃孵育60 min，洗板，空白孔外加入酶結合物工作液(100μl/孔)封住反應孔，37℃孵育30min，洗板，加入顯色劑37℃孵育20 min，加入終止液,測OD450值。 8、TGF-βl免疫組化檢測 將上述培養(yǎng)于6孔板中蓋玻片上14天人臍靜脈內皮細胞應用95％乙醇固定過夜，30％過氧化氫水和100％甲醇混合液(1:50)室溫浸泡30 min，以滅活內源性過氧化物酶。PBS沖洗2次，滴加正常山羊血清

10、封閉液，室溫20 min，傾余，不洗，每張片滴加兔抗人TGF-βl多克隆抗體(1:50)4℃過夜；PBS沖洗，加生物素標記的山羊抗兔IgG二抗，20℃孵育20 min，PBS沖洗；滴加鏈霉菌抗生物素一過氧化物酶溶液SABC 20℃20 min，PBS沖洗。DAB顯色15 min，蘇木素復染，中性樹膠封片。 9、Westernblot定量檢測 內皮細胞接種于250ml培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)14天后將細胞收集。收集的細胞懸于250

11、μl冰冷緩沖液中將細胞超聲粉碎，4℃12000g離心60 min，沉淀。吸取上清，考馬斯亮藍法(Bradford法)測定樣本中蛋白濃度，然后將每個樣品中蛋白濃度調至相同。樣品中加入樣品緩沖液，沸水煮5 min，每個樣品取20μl上樣于lO％SDS-PAGE分離，BIO-RAD電泳板，雙板條件為150V，30mA。TTBS洗膜2次，與HRP標記羊抗兔IgG(1:5000)室溫孵育2小時。TBS洗膜2次，每次5min，加入顯色液30min，

12、采用Chemin Imager 5500型自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像并對蛋白顯色光密度值IDV進行測定和結果分析。Bax和bc1-2操作方法與其相同。 10、統(tǒng)計學處理 應用SPSS12.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)采用-x±s表示。組間差異顯著性比較t檢驗。 結論: 1、持續(xù)性高濃度葡萄糖將隨著葡萄糖濃度的增高呈正相關誘導血管內皮細胞凋亡，而波動性高葡萄糖將比持續(xù)性高葡萄糖誘導血管內皮細胞凋亡率更高，所以，

13、波動性高葡萄糖對血管內皮細胞的損害較持續(xù)性高血糖更嚴重。表示波動性高血糖是誘導血管內皮細胞凋亡的獨立危險因子。 2、波動性高葡萄糖比持續(xù)性高葡萄糖更能促進抑制內皮細胞增殖的TGF-βl蛋白分泌及TGF-βl的mRNA表達。本研究提示波動性高血糖可能通過增加細胞炎癥因子導致內皮細胞發(fā)生損傷，增加內皮細胞凋亡的。 3、通過與THP-1和EcV304細胞同時培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：波動性高葡萄糖使血管內皮細胞分泌MMP-9蛋白含量及MMP-