1、背景與目的:Oct4,即octamer binding factor4,是POU(Pit-Oct-Unc)轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,該家族能夠與某些基因順式反應(yīng)元件中的Oct序列(ATGCAAAT)結(jié)合,激活或抑制轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)基因的表達,維持細胞的全能性。Oct4又被稱為POU5F1,OTF3,Oct-3/4或Oct3,其基因位于人染色體6p21.3,含有324個氨基酸,分子量18-KD。近年的研究發(fā)現(xiàn),Oct4幾乎專一表達于ES細胞中。

2、在胚胎發(fā)育的早期階段,Oct4表達于所有的卵母細胞,隨之表達于胚泡內(nèi)細胞群(ICM),而在滋養(yǎng)外胚層(TE)及原始內(nèi)胚層中的表達減少。在成體中,Oct4的表達僅限于發(fā)育中的生殖細胞。定向去除Oct4的大鼠,其胚胎缺乏多能性的ICM,這說明Oct4在維持胚胎細胞的多能性上有著重要的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)高水平的Oct4表達可促使ES細胞向中胚層、內(nèi)胚層細胞分化,低水平則向外胚層分化。具有正常水平Oct4的ES細胞仍可保持多能性。所以研究者認

3、為Oct4是干細胞具有多潛能性的重要調(diào)控因子。對Oct4進行深入研究可能將有助于揭示干細胞多潛能性的分子和細胞機制。在一些腫瘤細胞系中也存在Oct4的表達,如肝癌細胞系Mahlava、宮頸癌細胞株(HeLa)、胰腺癌Capan-2細胞系和Pan-1細胞系、弱致瘤性和高致瘤性人乳腺上皮干細胞、人乳腺癌細胞系-7(MCF-7)等。在表型上,人類植入前胚胎細胞與腫瘤細胞具有相似性,尤其在不定向生長分化能力方面。兩種細胞都需要經(jīng)歷重調(diào)而達到增殖

4、狀態(tài),從而具有永生、自我更新和侵襲能力。這些相似性說明在腫瘤細胞中可能有一些胚胎基因的重新表達或激活。Oct4基因可能是一個特異的分化全能性基因標(biāo)記,或者是分化全能性的必需基因,與腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系,表達Oct4的細胞可能是引起腫瘤發(fā)生過程的靶細胞。對Oct4加以認識可能發(fā)現(xiàn)一些新的惡性腫瘤的治療方法。SSEA-1(stage specific embryonic antigen-1)階段特異性胚胎抗原-1,又被稱為Lewis x(L

5、ex,CD15),是一個具有Galβ(1-4)(半乳糖)Fucα(1-3)(巖藻糖)GlcNAcβ(1-3)(乙酰氨基半乳糖)結(jié)構(gòu)的三糖。在哺乳動物胚胎發(fā)育的8細胞后期開始出現(xiàn)SSEA-1的表達,在桑椹胚中表達的量最高,隨后表達于ICM及內(nèi)胚層,著床后的滋養(yǎng)外胚層不再有SSEA-1的表達,而原始生殖細胞表面又再次出現(xiàn)SSEA-1。在成年小鼠的腎小管、精子、輸卵管、子宮內(nèi)膜、神經(jīng)干細胞和小腦均有SSEA-1分布;在成年人體的神經(jīng)細胞、神經(jīng)

6、膠質(zhì)細胞、外周血白細胞和紅細胞表面、胃上皮細胞均能檢測到SSEA-1;在多種腫瘤如乳腺癌,結(jié)腸癌,霍奇金淋巴瘤和急性早幼粒細胞白血病中也能檢測到SSEA-1。腫瘤細胞表面表達的SSEA-1和唾液酸化的SSEA-1已被作為腫瘤患者轉(zhuǎn)移和預(yù)后的監(jiān)測指標(biāo)。已有的研究認為SSEA-1與受精、胚胎發(fā)生、神經(jīng)發(fā)育過程中的細胞識別有關(guān):SSEA-1介導(dǎo)動物胚胎桑椹胚時期細胞的識別與黏附;介導(dǎo)胚泡與子宮內(nèi)膜細胞的識別,完成胚泡著床過程;還介導(dǎo)了動物上皮

7、細胞間的識別、黏附與致密性組織結(jié)構(gòu)的形成。另有研究證實人類精子表面的SSEA-1在精卵結(jié)合過程中發(fā)揮了一定的作用。Maria Teresa Elola等有一項關(guān)于MCF-7和人多形核中性粒細胞(PMN)與人臍血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)粘附的研究,其結(jié)果證實MCF-7癌細胞和PMN能夠與HUVEC結(jié)合,且其結(jié)合過程與SSEA-1有關(guān),他們的證據(jù)是這種粘附能夠被抗SSEA-1單抗MCS-1阻滯。該結(jié)果顯示SSEA-1是腫瘤細胞與血管內(nèi)皮相互

8、作用過程中一個必不可少的因子,這樣就給我們提供了一個通過相應(yīng)單抗進行抑制的靶位,也意味著防止腫瘤細胞的粘附和轉(zhuǎn)移成為可能。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率逐年上升。在歐美國家,乳腺癌占女性惡性腫瘤的25％~30％。20世紀末的統(tǒng)計資料表明全世界每年約有130萬人被診斷為乳腺癌,而有40萬人死于該病。在我國,乳腺癌在城市中的發(fā)病率為女性惡性腫瘤的第二位,一些大城市中已經(jīng)上升至第一位,農(nóng)村中為第五位。乳腺癌已經(jīng)成為婦女健康的最大威

9、脅。自20世紀90年代以來,隨著早期診斷和綜合治療的進步,特別是術(shù)后輔助治療的進步,北美和英國等國家的乳腺癌死亡率有所下降。但由于腫瘤病因、發(fā)生發(fā)展以及生物學(xué)行為的復(fù)雜和不均一性,臨床腫瘤的異質(zhì)性等因素,惡性腫瘤的治療效果對每個患者來說并不十分確切,乳腺癌也不例外,因此,在遵循綜合治療、個體化等原則的基礎(chǔ)上,尋找與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的因素,探尋乳腺癌治療的新靶點,新方法,是十分必要的。Oct4和SSEA-1在乳腺癌中的研究都處于初

10、步階段,在乳腺癌組織中是否存在確切表達?其有何意義?目前還都是空白。即使在細胞系中的研究也僅有個別報道。鑒于此,本課題研究目的包括：
　　1.探討乳腺癌細胞系及乳腺癌組織中是否存在Oct4和SSEA-1的表達;
　　2.觀察Oct4和SSEA-1在乳腺癌細胞系和乳腺癌組織中的表達情況及其意義。
　　材料與方法:1.材料:組織標(biāo)本與細胞系組織標(biāo)本:取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院05~07年手術(shù)切除組織,包括93例乳腺浸潤性導(dǎo)管

11、癌組織(患者均為首次發(fā)病,女性,術(shù)前未接受化療和放療);32例乳腺良性病變組織;2例精原細胞瘤組織。所有標(biāo)本均經(jīng)病理專家證實。細胞系:人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-468均由河南省腫瘤病理重點實驗室惠贈。細胞分別復(fù)蘇后置于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中,于飽和濕度、37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使其貼壁生長。0.25％胰酶消化傳代,實驗均選用對數(shù)生長期細胞。
　　2.組

12、織標(biāo)本切片后采用免疫組織化學(xué)PV兩步法檢測Oct4的表達情況,SP法檢測SSEA-1的表達情況。
　　3.選對數(shù)生長期細胞消化離心,采用血漿和凝血酶包裹成細胞團塊,常規(guī)固定、包埋、切片,檢測方法同組織切片。
　　4.評分方法:綜合考慮切片中陽性細胞占所觀察同類細胞數(shù)的百分比和陽性細胞著色強度兩項指標(biāo),半定量判斷結(jié)果。根據(jù)陽性細胞在所觀察細胞中所占比例分為:陽性細胞數(shù)≤10％為1分;11％~50％為2分;51％~75％為3分;

13、>75％為4分。根據(jù)顯色程度判斷陽性強度:標(biāo)本無著色為0分;淡黃色為1分;棕黃色為2分:棕褐色為3分。兩者分數(shù)乘積0~2分為(-);3~4分為(+);6~8分為(++);8分以上為(+++)。
　　5.統(tǒng)計學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0處理,統(tǒng)計方法采用X2檢驗。當(dāng)P<0.05時,認為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果:1.組織切片
　　1.1、Oct4在乳腺癌中的表達率為45.2％(42/93),在乳腺良性病變

14、中的表達率為3.1％(1/32)。與乳腺良性病變相比,乳腺癌中Oct4的表達率明顯增高(P<0.05)。Oct4在乳腺癌各分子亞型中的表達率為:Luminal A型34.5％,LuminalB型33.3％,HER2過表達型66.7％,Basal-like型88.2％。乳腺癌不同分子亞型中Oct4的表達率不同,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　1.2、SSEA-1在乳腺癌及乳腺良性病變中的陽性率均<5％。
　　2.細胞切片
　

15、　2.1、Oct4在兩種細胞系中的陽性率均<1％。
　　2.2、SSEA-1在兩種細胞系中的陽性率均>90％。
　　結(jié)論:1.乳腺癌中存在Oct4的表達;乳腺癌中Oct4的表達率明顯高于乳腺良性病變;乳腺癌中Oct4的表達率與分子亞型相關(guān),其中Basal-like型表達率最高。
　　2.乳腺癌及良性病變中SSEA-1表達率低,其臨床病理相關(guān)性尚不明確。
　　3.Oct4和SSEA-1在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系中的