1、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor4，OCT4)，是POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，對于維持胚胎干細胞(embryonic stem cells，ES細胞)的多能性和自我更新具有十分重要的作用，并且OCT4是目前產(chǎn)生誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells)的一個必需因子。近年來，OCT4在人類腫瘤中的表達和意義也日益成為研究的熱點?，F(xiàn)已證實，OC

2、T4基因在多能性生殖細胞腫瘤中有表達，并且其表達與多能性細胞的致瘤性有關(guān)。但是，體細胞腫瘤中是否表達OCT4仍有較大爭議。許多研究報道，OCT4表達于成體干細胞和多種體細胞腫瘤中，而且腫瘤中的OCT4陽性細胞很可能就是腫瘤干細胞(cancer stemcells，CSCs)，甚至有人報道，OCT4的表達對于維持干細胞樣腫瘤細胞的存活和自我更新都是必需的。盡管如此，也有大量研究表明，OCT4在多種體細胞腫瘤和腫瘤細胞系中不表達。因此，為了

3、更好的闡明腫瘤發(fā)生的分子機制，首先應該確定OCT4在人類體細胞腫瘤中是否有表達。
　　 一般來說，腫瘤細胞具有無限增殖、相對未分化和侵襲性等特征，這些都與早期胚胎細胞非常相似。但是，大多數(shù)腫瘤中的細胞群體都是異質(zhì)性的，既有非常幼稚的細胞，也有幾乎完全分化的細胞。隨著干細胞理論在腫瘤研究中的應用，腫瘤中的未分化細胞即被稱為CSCs。CSCs具有自我更新能力并且能夠分化產(chǎn)生非致瘤性腫瘤細胞，正是腫瘤中存在的一小部分CSCs促進了腫瘤

4、的形成和生長。到目前為止，許多研究者已經(jīng)從多種腫瘤組織中成功分離培養(yǎng)出CSCs，包括膠質(zhì)瘤和乳腺癌。最近有學者提出，CSCs可能來源于自我更新失調(diào)的正常干細胞或者重新獲得自我更新能力的祖細胞或已分化細胞。不管怎樣，自我更新機制的異常激活是腫瘤發(fā)生中的一個重要事件。因此，研究腫瘤中包括OCT4在內(nèi)的參與干細胞自我更新機制的基因的表達和意義就變得十分迫切和重要。
　　 人類OCT4基因位于6號染色體，包含5個外顯子和4個內(nèi)含子。OC

5、T4基因通過轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接形成兩種變異體-OCT4A和OCT4B。它們翻譯形成的蛋白質(zhì)具有相同的POU和C端結(jié)構(gòu)域，而N端結(jié)構(gòu)域則不同。OCT4A定位于細胞核內(nèi)，具有維持ES細胞自我更新的功能；而OCT4B主要位于細胞漿中，并且不具有維持ES細胞自我更新的功能。通常所說的OCT4指的是OCT4A。另有研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組中存在6個OCT4假基因(pseudogenes)，它們與OCT4基因有很高的序列同源性。有人報道，OCT4B表達

6、于多種體細胞腫瘤細胞系中，而兩個OCT4假基因--OCT4-pg1和OCT4-pg5在多種體細胞腫瘤組織和細胞系中都有轉(zhuǎn)錄。OCT4基因剪接異構(gòu)體和假基因的存在和表達都有可能導致OCT4檢測的假陽性實驗結(jié)果。因此，檢測OCT4基因的表達時，需要將真正的OCT4與其剪接變異體和各種假基因區(qū)分開來。
　　 雖然已有報道表明，可能是OCT4剪接變異體和假基因的存在導致了目前腫瘤和干細胞研究中OCT4是否表達的相悖結(jié)果，但是這一問題還沒

7、有引起人們足夠的重視。在本研究中，我們利用RT-PCR和DNA測序分析的方法檢測OCT4在兩種體細胞腫瘤--膠質(zhì)瘤和乳腺癌中的表達狀況。我們的實驗結(jié)果顯示，這兩種腫瘤中沒有檢測到真正的OCT4基因的表達，檢測出的是三種OCT4假基因--OCT4-pg1、OCT4-pg3和OCT4-pg4。我們進一步研究了它們的蛋白表達情況，并對這些蛋白產(chǎn)物的功能和活性進行了探討。
　　 第一部分膠質(zhì)瘤和乳腺癌中OCT4假基因的克隆與測序分析

8、r>　　 為了檢測OCT4在人膠質(zhì)瘤和乳腺癌組織中的表達情況，我們共收集了42例膠質(zhì)瘤和45例乳腺癌的臨床標本。所有的腫瘤標本均經(jīng)過最后的病理診斷證實，膠質(zhì)瘤按照世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的標準進行分級，而乳腺癌依據(jù)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人類表皮生長因子受體2(HER2)的表達情況進行分型。作為正常對照的4例成人腦組織和5例乳腺組織均取自于外傷病人。在RT-PCR過程中，我們利用兩對引物來檢測OCT4 mRNA的表達

9、。OCT4A特異性引物能夠特異性擴增OCT4A，而OCT4全長引物能夠擴增OCT4A的全長編碼序列。當用OCT4A特異性引物進行擴增時，除陽性對照精原細胞瘤外，各級別各類膠質(zhì)瘤、各類型乳腺癌、正常腦組織和乳腺組織中都沒有檢測到OCT4 mRNA(496bp)的表達；而當用OCT4全長引物進行擴增時，各級別各類膠質(zhì)瘤和各類型乳腺癌中都能檢測到陽性條帶(1086bp)。此外，我們還檢測了OCT4 mRNA在多種人膠質(zhì)瘤和乳腺癌細胞系中的表達

10、情況。當用OCT4A特異性引物進行擴增時，除陽性對照人多能性胚胎癌細胞系NTera-2外，人膠質(zhì)瘤細胞系U251和U87，乳腺癌細胞系MCF7、MDA-MB-231、BT474和SK-BR-3中都沒有檢測到OCT4 mRNA(496bp)的表達；而當用OCT4全長引物進行擴增時，這幾種腫瘤細胞系中都能檢測到陽性條帶(1086bp)。
　　 下一步，我們利用DNA克隆和測序分析來確定膠質(zhì)瘤和乳腺癌中是否有真正OCT4基因的表達。首

11、先，我們從瓊脂糖凝膠中回收由OCT4全長引物擴增得到的DNA片段(1086bp)，克隆入pGEM-T easy載體中形成環(huán)狀質(zhì)粒，質(zhì)粒擴增后進行酶切鑒定，插入片段大小正確的克隆再進行測序分析。測序結(jié)果顯示，OCT4基因的轉(zhuǎn)錄本只在陽性對照精原細胞瘤和NTera-2細胞中被檢測到，而在本研究收集的各種腫瘤組織和腫瘤細胞系中未檢測到真正OCT4基因的表達，檢測到的是三種OCT4假基因，即OCT4-pg1、OCT4-pg3和OCT4-pg4，

12、它們分別位于人類染色體8q24、12p13和1q22。我們的測序結(jié)果表明，當用OCT4全長引物進行擴增時，正是腫瘤組織和細胞系中存在的這些OCT4假基因的轉(zhuǎn)錄本導致了RT-PCR的陽性結(jié)果。
　　 第二部分 OCT4假基因蛋白的表達與定位研究
　　 從理論上來說，OCT4-pg1、OCT4-pg3和OCT4-pg4的轉(zhuǎn)錄本能夠分別翻譯生成由359、186和286個氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物。盡管存在著氨基酸缺失或替代，這三種O

13、CT4假基因的蛋白產(chǎn)物都有與OCT4蛋白相似的N端結(jié)構(gòu)域。
　　 為了研究OCT4假基因的蛋白表達和細胞內(nèi)定位，我們構(gòu)建了它們的真核表達質(zhì)粒，并使它們的C端帶有HA標簽，以便于檢測。將它們分別轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3后，進行免疫細胞化學染色。結(jié)果顯示，與OCT4相似，OCT4-pg1和OCT4-pg4主要位于細胞核內(nèi)，而OCT4-pg3主要位于細胞漿中。OCT4-pg1和OCT4-pg3還能被兩種OCT4抗體--ab1

14、8976和sc-5279所識別，而OCT4-pg4不能被這兩種抗體所識別。轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞系U251和乳腺癌細胞系MCF7得到了與NIH3T3相似的結(jié)果，不同的是OCT4-pg3在這兩種腫瘤細胞的細胞核和細胞漿中都有分布。Western blot結(jié)果顯示，OCT4-pg1、OCT4-pg3、OCT4-pg4和OCT4蛋白產(chǎn)物所對應的條帶分別位于50、30、30和50 KDa。與免疫細胞化學結(jié)果一致，細胞核漿分離后進行的Western bl

15、ot檢測結(jié)果顯示，OCT4-pg1、OCT4-pg4和OCT4位于NIH3T3的細胞核中，而OCT4-pg3位于細胞漿中。另外，Western blot結(jié)果顯示，OCT4-pg1和OCT4-pg3還能被OCT4抗體sc-5279所識別。兩種OCT4抗體都不能識別OCT4-pg4，可能與OCT4-pg4蛋白的N端存在較多的氨基酸缺失或替代有關(guān)。
　　 下一步，我們利用免疫化學染色檢測了OCT4假基因在腫瘤細胞中的內(nèi)源性表達。當用O

16、CT4抗體ab18976進行免疫染色時，與NTera-2細胞中明顯的核著色不同，熒光信號在幾乎所有U251和MCF7細胞的細胞核和細胞漿中都能檢測到，說明這些腫瘤細胞中表達OCT4假基因。同樣，與精原細胞瘤中廣泛的核著色相比，人膠質(zhì)瘤和乳腺癌組織中只有一小部分細胞能著色，并且一些細胞的細胞核和細胞漿中都有陽性著色，說明這些腫瘤組織中有OCT4假基因的表達。在膠質(zhì)瘤中，能被ab18976陽性染色的細胞也能同時表達腫瘤干細胞標志物CD133

17、或者星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP，說明膠質(zhì)瘤中OCT4假基因的表達并不局限于CSCs中。
　　 本實驗結(jié)果表明，當檢測腫瘤組織中OCT4的表達時，OCT4假基因蛋白的表達在免疫化學染色和 Western blot中都可能產(chǎn)生假陽性實驗結(jié)果。這可能也是導致目前關(guān)于腫瘤和干細胞中OCT4是否表達的相悖研究結(jié)果的原因。
　　 第三部分 OCT4假基因蛋白的活性與功能研究
　　 為了研究OCT4假基因的生物學功能，我們用O

18、CT4及其假基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞系U251、U87和乳腺癌細胞系MCF7、MDA-MB-231。轉(zhuǎn)染后各個時間點的細胞活力用MTT實驗來檢測。結(jié)果顯示，OCT4轉(zhuǎn)染組腫瘤細胞的細胞活力明顯高于對照組，而各OCT4假基因轉(zhuǎn)染組的細胞活力與對照組相比沒有明顯差別。細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，OCT4轉(zhuǎn)染組腫瘤細胞的克隆形成率明顯高于對照組，而各OCT4假基因轉(zhuǎn)染組細胞的克隆形成率與對照組相比沒有明顯差別。OCT4假基因不能增加腫瘤細胞

19、的細胞活力，也不能促進腫瘤細胞的克隆形成率，說明OCT4假基因?qū)δ[瘤細胞的增殖無明顯作用。最后，我們利用熒光素酶報告基因檢測的方法檢測了這三種OCT4假基因的轉(zhuǎn)錄激活功能。OCT4能夠明顯激活三種OCT4依賴的熒光素酶報告基因載體(6×W、PORE和MORE)，而三種OCT4假基因與空載體PCDNA3相比無明顯差別，說明OCT4-pg1、OCT4-pg3和OCT4-pg4對這三種OCT4依賴的熒光素酶報告基因載體無明顯的轉(zhuǎn)錄激活功能。<

20、br>　　 這三種OCT4假基因與真正OCT4基因的高度同源性提示它們可能具有相似的生物學功能，但本研究結(jié)果顯示，OCT4-pg1、OCT4-pg3和OCT4-pg4不具有類似OCT4的功能。OCT4假基因在腫瘤中表達的意義以及它們在腫瘤發(fā)生中的作用有待于進一步研究。
　　 總之，通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，人類膠質(zhì)瘤和乳腺癌中表達三種OCT4假基因-OCT4-pg1、OCT4-pg3和OCT4-pg4，而沒有真正OCT4基因的表達，