1、與哺乳類動物和鳥類的胚胎發(fā)育不同，硬骨魚類基本上是體外受精體外發(fā)育，其肝臟發(fā)育過程中會遇到內(nèi)在或外在壓力，因此需要啟動一些機(jī)制消除或者中和外界壓力誘導(dǎo)的有害物質(zhì)，使得胚胎發(fā)育處在最佳的外界環(huán)境中。但是當(dāng)環(huán)境壓力太大，體內(nèi)機(jī)制不足以保護(hù)正常的胚胎發(fā)育時(shí)，就會導(dǎo)致細(xì)胞周期受阻、細(xì)胞死亡或者衰老。因此，在長久進(jìn)化過程中，硬骨魚類需要一套完善的抗壓保護(hù)機(jī)制來保護(hù)胚胎發(fā)生和器官形成。而這種抵抗外界環(huán)境的機(jī)制或者方式是發(fā)育生物學(xué)有志探究卻又知之甚少

2、的領(lǐng)域。
　　leg1（liver enriched gene1，肝臟富集基因1）是一個(gè)功能未知的基因。leg1在斑馬魚基因組中存在leg1a和leg1b兩個(gè)拷貝，序列比對發(fā)現(xiàn)leg1a和leg1b兩個(gè)基因，結(jié)構(gòu)相近、序列相似、串聯(lián)定位在第20號染色體上。兩個(gè)基因都編碼著一條361個(gè)氨基酸多肽，兩條多肽高度相似，一致性達(dá)90.6％。leg1編碼一種新型的分泌蛋白，該蛋白包含一個(gè)功能未知的結(jié)構(gòu)域DUF781(domain ofunk

3、nown function781)，序列分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在脊椎動物中是保守的。
　　我們采用TALEN技術(shù)獲得了兩個(gè)lega突變體品系，即leg1zju1和leg1zju2。通過整胚原位雜交方法我們觀察了兩個(gè)突變體中肝臟發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)leg1a母源-合子型突變體僅在壓力條件下（如高密度高溫或UV照射或H2O2處理）表現(xiàn)出小肝臟表型。由于在UV照射或H2O2處理?xiàng)l件下同時(shí)添加抑制ROS產(chǎn)生的化合物APO和DPI能挽救以上壓力條件下le

4、g1a母源-合子型突變體的小肝臟表型，說明這些壓力條件下ROS的過量產(chǎn)生是導(dǎo)致小肝臟表型的原因。用肝臟早期發(fā)育的分子標(biāo)記如foax3，gata6，prox1以及hhex做整胚原位雜交顯示，在壓力條件下Leg1a的缺失導(dǎo)致了肝臟細(xì)胞周期嚴(yán)重阻滯，從而使得肝芽的形成受到了影響，并最終致使leg1 azju1母源-合子型突變體的肝臟明顯小于野生型的。有趣的是我們發(fā)現(xiàn)Leg1a的缺失對其它消化器官的發(fā)育影響不明顯，僅外分泌胰腺發(fā)育受到些微抑制。

5、在Leg1a作用機(jī)理研究方面，我們通過1eg1a mRNA注射到魚卵發(fā)現(xiàn)在壓力條件下Leg1a促進(jìn)Erk的磷酸化，通過將表達(dá)Leg1a的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Leg1a可能與FGFR3相互作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)，壓力條件下，Leg1a第70位天冬酰胺(N70)糖苷化修飾突變?yōu)楸彼岷蟛荒芗せ頔rk信號通路，不能保護(hù)肝臟發(fā)育，同時(shí)N70連接的糖苷化修飾對于Leg1a與FGFR3相互作用非常重要。
　　綜上所述，本課題研究發(fā)現(xiàn)，Leg