1、學校代碼：幽分類號：絲研究生學號：星QQ墾!Q至絲密級：玉⑧東北埽冠媳博士學位論文抗成纖維細胞生長因子1單鏈抗體介導的乳腺癌治療研究StudiesonbreastcancertreatmentmediatedbyscFvlC9specificforFGF一1作者：施恒亮指導教師：朱筱娟教授學科專業(yè)：細胞生物學研究方向：腫瘤靶向治療東北師范大學學位評定委員會2011年5月摘要成纖維細胞生長因子1(Fibroblastgrowthfacto

2、r1，F(xiàn)GF1)是成纖維細胞生長因子超家族成員之一，具有廣泛的生物學作用，對多種類型細胞具有促分裂作用，并能促進血管的形成。近年研究結果表明FGF一1在多種腫瘤組織中高表達，提示FGF1可能與腫瘤的發(fā)生和轉移具有一定的相關性。本研究首先通過免疫組化分析了FGF1在正常乳腺組織、良性纖維瘤和乳腺導管癌組織中的表達水平。結果顯示，F(xiàn)GF1在乳腺導管癌組織中高表達。推測FGF1可以作為乳腺癌治療的一個新的靶點。為此，本實驗室制備了特異性針對F

3、GF1的雜交瘤，并從該雜交瘤中克隆了抗體輕鏈可變區(qū)基因(Variablelightchain，VL)和重鏈可變區(qū)(VariableheavychainVH)基因，構建成單鏈抗體(scFvlC9)，以此作為中和FGF1的工具。共表達GFPscFvlC9與HAFGF1于MCF7細胞中，免疫沉淀結果顯示scFvlC9與FGF1共沉淀，表明scFvlC9在體外有效結合抗原。為了分析scFvlC9的中和能力，通過慢病毒介導scFvlC9在MCF7

4、細胞中穩(wěn)定表達預先中和FGF1的生物學功能，再將細胞在體回輸?shù)絅OD／SCID小鼠體內，分析誘發(fā)小鼠成瘤的能力。結果顯示預先中和FGF1明顯地使MCF7誘導腫瘤能力降低，進一步證明了FGF1參與了乳腺癌的發(fā)生。為了分析scFvlC9中和FGF1功能的生物學機制，隨后將pEGFPC1和pEGFPscFvlC9分別轉染到乳腺癌細胞MCF7，免疫熒光染色表明，表達GFP的細胞中內源性的FGF一1分布于細胞質和細胞核，而表達GFPscFvlC9

5、的細胞內源性的FGF1僅分布在細胞質。說明scFvlC9在MCF7細胞中表達阻止了FGF1進入細胞核。FGF一1具有兩條信號通路，一條是經(jīng)典的受體依賴型信號通路；另一條是依賴入核的胞內信號通路。由此我們推測scFvlC9影響FGF1入核進一步會阻斷FGF1的胞內信號通路。pEGFPC1和pEGFPscFvlC9轉染的MCF7細胞周期分析結果顯示，表達GFP的細胞周期分布為：G0／G1：5758％，S：2531％，G2／M：1117％，表

6、達GFPscFvlC9的細胞周期分布為：G0／G1：7382％，S：916％，G2／M：611％，其G0／G1期的細胞明顯增多，表現(xiàn)出細胞衰老的表型，細胞增殖指數(shù)明顯降低。進而，通過定量ELISA實驗證明了scFvlC9的表達不影響FGF1的胞外分泌。從而推測scFvlC9不影響FGF1的受體依賴型信號通路。為了進一步證明scFvlC9過表達阻斷了FGF1胞內信號通路，首先通過RTPCR證明FGF1基因本身的表達水平?jīng)]有受到影響。其次通