1、目的：(1)體外分離培養(yǎng)并鑒定SD大鼠肝枯否細胞，得到較高純度及細胞活力的KCs，為進一步實驗提供充足的KCs。(2)構建鼠重組IL．12腺病毒，得到能高度及穩(wěn)定表達IL．12的腺病毒載體，為進一步基因治療提供有效基因轉運載體。(3)利用KCs的吞噬作用，檢測經脂質體包埋的鼠重組IL-12腺病毒在KCs中IL．12的表達，為靶向治療肝癌肝內微轉移灶的治療提供實驗依據(jù)。 方法：(1)采用Ⅳ型膠原酶離體灌注消化、重復離心等方法將大鼠

2、肝臟非實質細胞(nonparenchymalcells,NPC)和實質細胞(肝細胞)(parenchymalcells)分離開來，并將NPC進行貼壁培養(yǎng)，進一步分離出其中的KCs，相差顯微鏡下觀察KCs的貼壁及生長情況，臺盼藍染色判斷細胞產率和存活率。KCs的鑒定：運用latexbeads顆粒進行KCs吞噬功能實驗；熒光顯微鏡觀察首次換液后的KCs,置328nm波長下觀察細胞自發(fā)熒光的情況。(2)利用細菌內重組系統(tǒng)AdEasyTMSys

3、tem，及腺病毒載體pCAl3-miLl2質粒，構建鼠重組IL．12腺病毒(Adv-mILl2)。PCR法、酶切鑒定證實重組是否正確。50％組織培養(yǎng)感染劑量(TCIDS0)法測定病毒滴度。(3)細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)KCs，共28孔，細胞濃度為1X106／ml。每7孔為一組，共設置4組，分別為KC細胞對照組、KC+脂質體+Ad-miLl2組、KC+Ad-mILl2對照組、KC+Ad-EGFP病毒對照組。置于二氧化碳培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7天，每天觀

4、察細胞生長形態(tài)，其中KC+Ad-EGFP病毒對照組熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況；并每天取4組的平行4孔細胞上清，一80℃冰箱保存，至7天后ELISA試劑盒(mill2)檢測細胞上清中mill2的表達量。 結果：(1)實驗分離所得的肝KCs以培養(yǎng)基稀釋后用O．4％的臺盼藍染色計數(shù)，每只大鼠可得到7．10X106個細胞，且細胞的存活率可達到95％以上。KCs在倒置顯微鏡下呈圓球形，折光性強，懸浮于培養(yǎng)基中；4h后見部分已貼壁，呈扁圓

5、形，12h見大量細胞開始伸展生長貼壁良好，24h時細胞己完全展開，細胞體積明顯增大，外形不規(guī)則，細胞呈現(xiàn)典型的星形或多角形，胞漿透明：胞核呈腎形且偏位。吞噬功能實驗相差顯微鏡下見KCs胞漿內含有被大量吞噬的latexbeads顆粒。熒光顯微鏡觀察在328nm處未見明顯的細胞自發(fā)熒光現(xiàn)象。(2)運用PCR法、酶切鑒定法對pShuttle-mlLl2載體及pAdEasy-mLLl2重組子鑒定，均證實基因重組正確。TCID50方法測病毒滴度為

6、2．5XlO7pfu／ml。(3)實驗用KCs在培養(yǎng)板中生長良好，形態(tài)典型。由于不添加新的培養(yǎng)基，至第5天細胞數(shù)量逐漸減少，但細胞形態(tài)改變不顯著。對照組由于有腺病毒的存在，其細胞毒作用使得該3組的KC細胞數(shù)較KC細胞對照組為少。KC+Ad-EGFP病毒對照組在熒光顯微鏡下觀察早期見熒光表達，隨著KC數(shù)量的減少，熒光表達有所減少。ELISA試劑盒檢測細胞上清中mill2的表達量：KC+脂質體+Ad-miLl2組、KC+Ad-mILl2對照

7、組細胞上清中mill2第1天至第7天均有表達，且表達量高，該兩組間無顯著性差異，且每組各天之間表達量也無顯著性差異。KC細胞對照組、KC+Ad-EGFP病毒對照組細胞上清中未檢測出或檢測出極低的mill2，與KC+脂質體+Ad-miLl2組、KC+Ad-mILl2對照組有顯著性差異。 結論：(1)我們采用Ⅳ型膠原酶離體灌注消化、重復離心法，原代分離、培養(yǎng)肝KC取得的較為滿意的結果。所得KCs具有典型的形態(tài)和較高細胞活力，純度高，

8、為進一步研究KCs的功能提供了一套成熟的細胞分離培養(yǎng)的方法。(2)成功構建了鼠重組IL．12腺病毒，具有較高的轉染效率，能穩(wěn)定、高效表達IL一12。為IL．12相關的基因治療提供了高效的基因載體，從而可以在更廣闊的領域得到應用，尤其是腫瘤的基因治療。(3)通過鼠重組IL．12腺病毒經脂質體包埋轉染Kupffer細胞的研究，并檢測到KCs細胞上清中IL．12的高度表達，證實了該種方法的可行性和有效性，為進一步體內實驗提供了依據(jù)。通過KCs