1、目的：研究胰島素樣生長因子－II(IGF-II)對體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲作用的影響。 方法： 一、人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的純化培養(yǎng)。從6例妊娠6～8周患者人工流產(chǎn)的絨毛組織中獲取滋養(yǎng)層細(xì)胞，用percoll液密度梯度進行分離純化培養(yǎng)，種植在預(yù)先包被matrigel(matrigel：DMEM=1：2)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，以獲得高純度的符合實驗需要的滋養(yǎng)層細(xì)胞。 二、胰島素樣生長因子II對滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移作用的影響。

2、將滋養(yǎng)細(xì)胞接種于包被matrigel的24孔板中，每例接種10孔，待細(xì)胞長滿后，用100μL槍頭在每孔中間劃一豎線，用PBS液清洗3遍后更換為含1％FBS的培養(yǎng)液，其中分別含IGF-II濃度為0μg/L,10.5μg /L,26.5μg /L,52.5μg /L,112.5μg /L。分別在6，12，24小時測定豎線的間距，每一固定位置的距離減去初始時同一位置的距離便為在此時間段內(nèi)細(xì)胞遷移的距離。 利用劃痕實驗，每一濃度各加兩孔

3、，劃線后，在每一孔下劃三道橫線以固定每次測量的位置。測距后放入37，5％CO ℃ 2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在6，12，24小時測定豎線的間距，每一固定位置的距離減去初始時同一位置的距離便為在此時間段內(nèi)細(xì)胞遷移的距離。數(shù)據(jù)分析分為兩組：劑量依賴性分析和時間依賴性分析。 三. 胰島素樣生長因子Π對滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲作用的影響。參考Sato Y建立的方法[8]并加以改進。在Transwell板(8微米孔徑、6.4mm膜直徑)濾膜表面包被ma

4、trigel 100微升(matrigel：DMEM=1：6)，在37，5％CO ℃ 2的培養(yǎng)箱中放置5個小時。使用前2小時加入37℃預(yù)溫的DMEM高糖培養(yǎng)液100微升水化。上室加入100微升滋養(yǎng)細(xì)胞懸液(1％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為6×105個／m1)，并分別加入IGF-II至終濃度為0μg/L，10.5μg/L，26.5μg/L，52.5μg/L，112.5μg/L；下室加入600微升含5％FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)

5、液，37℃、5％CO2 培養(yǎng)箱中孵育，每一濃度加兩個孔。實驗分為兩大組：①劑量依賴性分析。分為5組：對照組，不加IGF-II；終濃度10.5μg/LIGF-II組;終濃度26.5μg/LIGF-II組；終濃度52.5μg/LIGF-II組；終濃度112.5μg/LIGF-II組。加入不同濃度的IGF-II培養(yǎng)48h。②時間依賴性分析。分為4組：12h組、24h組、48h組、72h組。加入終濃度為52.5μg/LIGF-II，分別培養(yǎng)12

6、h、24h、48h、72h。測定遷移至下表面的細(xì)胞數(shù)目以統(tǒng)計分析藥物對滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲力的影響。 結(jié)果： 一、用percoll液密度梯度進行分離純化培養(yǎng)，種植在預(yù)先包被matrigel－(matrigel：DMEM=1：2)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的滋養(yǎng)層細(xì)胞純度可達90％以上。 二，胰島素樣生長因子II對絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞遷移作用的影響。實驗結(jié)果表明，IGF-II可明顯促進滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移，并且，隨著濃度和時間的增加其促進滋養(yǎng)

7、細(xì)胞的遷移能力增強。與對照組相比,各個濃度均顯著促進細(xì)胞的遷移性,且各組間均有顯著性差異,52.5μg/L與112.5μg/L之間無顯著性差異.在各濃度組,隨著時間的延長其促進細(xì)胞遷移力增加,且各組時間段均有顯著性差異. 三，胰島素樣生長因子II 對絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲作用的影響。①劑量依賴性分析： 實驗證實，IGF-II可明顯促進滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力，在相同的時間里，隨著濃度的增加而增加，與對照組相比,各個濃度均顯著促進細(xì)胞的

8、侵襲性,且各組間均有顯著性差異,52.5μg/L與112.5μg/L之間無顯著性差異. ②時間依賴性分析。加入終濃度為52.5μg/LIGF-II，在12，24，48，72小時分別測定侵襲至Transwell板下表面的細(xì)胞數(shù)目，隨著時間的延長其促進細(xì)胞侵襲力增加,12,24,48小時各組間有顯著性差異,48與72小時無顯著性差異.由此可知，IGF-II對滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力有濃度和時間依賴性。實驗重復(fù)2次。 結(jié)論： 一、用p

9、ercoll液密度梯度進行分離純化培養(yǎng)，種植在預(yù)先包被matrigel－(matrigel：DMEM=1：2)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶可獲得純度較高﹑合乎試驗要求的滋養(yǎng)層細(xì)胞。 二、IGF-II能顯著促進滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移力，且這種遷移力具有時間和劑量依賴性，52.5μg/LIGF-II 培養(yǎng)12小時達最佳量效反應(yīng)。 三、IGF-II能顯著促進滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲力，且這種侵襲力具有時間和劑量依賴性，52.5μg/LIGF-II培養(yǎng)48小