1、學校代碼：10225學號：S13165學位論文轉蜘蛛拖絲蛋白基因二聚體綿羊成纖維細胞株的篩選指導教師姓名：申請學位級別：論文提交日期：授予學位單位：王子竹安鐵洙教授碩士2013年4月東北林業(yè)大學東北林業(yè)大學學科專業(yè)：發(fā)育生物學論文答辯日期：2013年6月授予學位日期：2013年6月答辯委員會主席：論文評閱人：聾夕厶櫛案大學摘要蜘蛛絲是目前己知的一種集多種優(yōu)良性能于一身的纖維，無論與其它天然材料還是人工合成的材料相比，蜘蛛絲都顯示出了絕對

2、的優(yōu)勢。但是由于蜘蛛的生活習性以及織網(wǎng)特點，無法通過人工進行大規(guī)模飼養(yǎng)繁殖，這些都給蜘蛛絲的大量獲取造成了巨大困難。本研究通過綿羊可以產生由角蛋白構成的羊毛為啟迪，利用本實驗室前期合成的蜘蛛絲蛋白基因二聚體和綿羊毛發(fā)角蛋白啟動子B2C，將B2C與報告基因相連，驗證其是否具有表達活性，并將綿羊毛發(fā)角蛋白啟動子與pcDNA3。1相連構建真核表達載體，再與蜘蛛絲蛋白基因二聚體相連后轉染綿羊皮膚成纖維細胞，經抗性篩選后擴大培養(yǎng)，建立轉擬蜘蛛絲蛋

3、白基因二聚體綿羊皮膚成纖維細胞系。為后續(xù)產生被毛中表達蜘蛛拖絲蛋白的轉基因綿羊奠定了基礎。實驗的結果與結論如下：(1)綿羊毛發(fā)角蛋白啟動子B2C的活性檢測：將綿羊毛發(fā)角蛋白啟動子pEasyT3一B2C與報告基因GFP相連，構建重組質粒B2C—GFP，將其轉染綿羊皮膚成纖維細胞。結果在藍光激發(fā)下觀察到了綠色熒光，證明了該啟動子在綿羊皮膚成纖維細胞中具有表達活性；(2)真核表達載體的構建：將去除自身CMV巨噬細胞病毒啟動子的pcDNA31與

4、經過相同酶切的啟動子B2C相連接，再與蜘蛛拖絲蛋白基因二聚體2s相連接，成功構建了真和表達載體pcDNA31一B2C一2S；(3)轉基因陽性細胞的篩選：通過脂質體轉染法將線性化的pcDNA31一B2C一2S轉染綿羊皮膚成纖維細胞，用最適終濃度的G418對轉染后的細胞進行篩選，得到了生長狀態(tài)良好的轉基因細胞；(4)轉基因細胞的檢測：提取轉基因細胞的基因組DNA，通過PCR檢測顯示pcDNA31一B2C一2S整合到了綿羊皮膚成纖維細胞的基因