1、家蠶（Bombyx mori）屬鱗翅目蠶蛾科昆蟲，是迄今唯一被人類完全馴化并大規(guī)模飼養(yǎng)的經濟昆蟲。家蠶具有生長周期短、遺傳背景清楚、蛋白質翻譯后修飾系統(tǒng)、絲蛋白高效合成和分泌能力、飼養(yǎng)成本低和可規(guī)?；曫B(yǎng)等優(yōu)點，是繼果蠅之后的重要模式昆蟲之一。隨著家蠶全基因組序列的測定，在基因組水平上加快鑒定和解析家蠶重要經濟性狀和生物學性狀相關基因，對于進一步提升家蠶作為鱗翅目昆蟲模式的研究價值，促進以基因改造利用為主線的蠶品種改良和新型遺傳素材創(chuàng)制

2、等具有深遠意義。
　　器官大小是多細胞生物體的重要生物學性狀，對于一些經濟動物而言，器官大小還決定著其產量或品質性狀。Hippo通路是迄今發(fā)現(xiàn)的一條控制動物器官大小的主要信號通路。自1995年在果蠅中發(fā)現(xiàn)Hippo通路以來，有關Hippo通路的研究取得了豐富進展，同時也顯示了Hippo通路復雜而多樣的調控機制。
　　本論文以家蠶全基因組數(shù)據(jù)和芯片表達譜數(shù)據(jù)為基礎，利用生物信息學方法，對家蠶Hippo通路成員進行全基因組鑒定，

3、并對核心成員BmHpo進行克隆和表達分析，取得的主要結果如下：
　　1.家蠶Hippo通路核心成員的鑒定與分析
　　利用序列同源比對方法，自家蠶中鑒定了四個Hippo通路核心成員BmHpo、BmMats、BmSav和BmWts，其中BmHpo和BmWts都含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域，BmSav含有四個WW結構域，BmMats含有Mob1_phocein結構域，這四個成員的蛋白結構域與果蠅Hippo通路核心成員的蛋白

4、結構域類似，表明其在功能或作用方式上亦類似。BmHpo在卵巢和馬氏管中的表達量相對較高，BmMats在脂肪體中表達量最高，BmWts和BmSav在變態(tài)發(fā)育階段的雌雄個體中具有類似的表達模式。
　　2.家蠶Hippo通路上游成員的鑒定與分析
　　利用序列同源比對方法，自家蠶中鑒定了49個上游成員。在47個具有組織表達信息的成員中，BmMop、BmJub、BmCrb、BmCi、BmSmurf、BmLft、BmMer為組織特異表達

5、基因；BmEx、BmZyx、BmFexL7、BmDpp、BmDlg、BmRassf、BmSTRIPAK、BmPP1、BmMop、Bmβ-cat、BmSlmb、BmDREF、BmCK2、Bm14-3-3、BmCsk等成員在卵巢或精巢中高量表達，推測他們可能參與調控家蠶精子及卵子的發(fā)生。同時這些高表達成員在絲腺組織中也有高量表達，暗示其可能在家蠶絲腺生長發(fā)育過程中發(fā)揮調控作用。
　　3.家蠶Hippo通路下游成員的鑒定與分析
　

6、　利用序列同源比對方法，自家蠶中鑒定了包括轉錄共激活因子BmYki在內的10個下游成員，其中BmYki在卵巢和前、后部絲腺中表達量相對較高，BmCbt、BmBrm和BmWbp2在絲腺、精巢和卵巢中表達量較高，BmMad在精巢和脂肪體中的表達量最高，BmMor在體壁和脂肪體中表達量較高，BmTsh在前部絲腺和后部絲腺表達相對較高，BmHth在雌蠶的后部絲腺和雄蠶中表達量相對較高，BmSdBP在雌蠶的前部及后部絲腺表達量相對較高，BmSd在

7、雄蠶的脂肪體中相對表達較高。
　　BmYki蛋白含有兩個WW結構域，含有高度保守的色氨酸殘基，能特異識別并結合富含脯氨酸的蛋白基序和磷酸化的氨酸/色氨酸-脯氨酸肽段。另外9個下游成員的蛋白結構域與果蠅中的相應下游成員類似，推測家蠶Hippo通路下游成員在通路中的功能或作用方式與果蠅類似，即BmYki作為最關鍵的下游成員，在調控下游靶基因表達過程中起核心作用，BmSd、BmTsh、BmHth、BmMad、BmCbt、BmBrm、Bm

8、Mor、BmWbp2和BmSdBP等9個成員通過與BmYki結合，協(xié)同BmYki入核調控下游靶基因。
　　4.家蠶Hippo通路核心成員BmHpo的克隆及表達分析
　　利用RT-PCR技術對家蠶Hippo通路核心基因BmHpo進行了擴增和克隆。BmHpo基因的CDS序列全長1479 bp，編碼492個氨基酸；BmHpo基因編碼的蛋白含有一個Hpo家族共有的Ster I-20 family S保守結構域。亞細胞定位結果顯示Bm

9、Hpo定位在細胞質中，與果蠅和哺乳動物中Hpo基因的定位結果一致。組織和時期轉錄表達分析表明，BmHpo基因在家蠶各組織中的表達水平較低，在精巢和頭部表達量相對較高；其在家蠶整個發(fā)育時期表達量普遍較低，這與Hippo通路屬于細胞生長抑制性信號通路吻合。
　　5.三種CRISPR/Cas系統(tǒng)的構建及轉錄表達驗證
　　根據(jù)從Addgene共享質粒數(shù)據(jù)庫下載的三種CRISPR/Cas系統(tǒng)的相應序列，經密碼子優(yōu)化后合成了帶有入核信號

10、的SpCas9、SaCas9和AsCpf1基因序列以及相應的gRNA表達載體序列，構建了以家蠶肌動蛋白Actin4（A4）為啟動子的3個Cas表達載體pUC57[A4-SpCas9-Ser1pA]、pUC57[A4-SaCas9-Ser1pA]和pUC57[A4-AsCpf1-Ser1pA]。細胞瞬時表達檢測結果顯示，SpCas9、SaCas9和AsCpf1基因在家蠶BmE細胞中均有較高水平的轉錄表達，表明其具有應用于家蠶基因組編輯的潛