1、福建農(nóng)林大學(xué)博士學(xué)位論文花生等三種植物的RAPD分析與花生再生和轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的初步研究姓名：陳由強(qiáng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：作物栽培學(xué)與耕作學(xué)指導(dǎo)教師：陳如凱;林彥銓2002.5.1摘要本研究包括四個(gè)部分：～、花生D N A 提取、P C R 反應(yīng)條件優(yōu)化及其栽培品種R A P D 的分析；二、長葉榧( T o r r e y a j a c M i C h u n ) 的R A P D 分析；三、應(yīng)用R A P D 技術(shù)對(duì)杉木地理種源遺

2、傳變異的分析；四、花生體細(xì)胞胚和叢生芽的誘導(dǎo)、再生及轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的初步研究。／ 在花生新鮮幼葉和干葉D N A 提取過程中，應(yīng)用p H 值較低無機(jī)鹽濃度較高的提取緩沖液沉淀蛋白質(zhì)，其中加入2 ％的0 ．巰基乙醇可有效地防L k 因次生代謝物質(zhì)引起的D N A 變色。提取出的D N A 樣品產(chǎn)率約9 2 6 ～2 1 6 ．3n g ／m g f w 之間，D N A 質(zhì)量和純度較高，2 6 0 n m ／2 8 0 n m 光密度比值在

3、1 ．8 ．1 ．9之間。所得D N A 可直接用于限制性內(nèi)切酶酶切，并可用于隨機(jī)引物P C R擴(kuò)增?；ㄉ鶵 A P D 理想的反應(yīng)體系如下，每1 0u 1 反應(yīng)體積中含：5 0 m m o l ／L K C l ，1 0 m m o l ／L T r i s ·H C l ( p H 9 ．o ) ，01 ％T r i t o n 一1 0 0 ，2 0 - 4 0 n g 引物，0 ．2 n m o l ／u l 的d N

4、 T P s ，1 ～2 u g ／u l 的B S A ，1 ．5 n m o l ／u l M g C l 2 ，0 ．5 - 1 單位T a q酶( 以上均為S a n g o n L i d ．產(chǎn)品) ，3 0 - - 6 0 n g 左右花生基因組D N A 。應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性D N A 技術(shù)對(duì)1 2 個(gè)花生品種遺傳多樣性進(jìn)行分析。從8 0 個(gè)隨機(jī)引物中篩選出2 0 個(gè)進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出1 8 0 條帶，其中1 3 2 條具

5、有多態(tài)性，占7 3 ．3 3 ％。平均每個(gè)引物提供9 個(gè)R A P D 標(biāo)記的信息量。計(jì)算了1 2 個(gè)花生品種的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。應(yīng)用U n w e i g h t e dp a i r - g r o u pa v e r a g e 方法進(jìn)行聚類分析。聚類結(jié)果金花3 9 ．2 —1 9 利金花3 9 ．2 ．5 1距離最近，并與它們父本泉花1 0 號(hào)聚為～類。金花1 0 1 ，金花1 0 3 和它們的父本汕油7 1 聚為一類。

6、白皮1 號(hào)與粵油2 0 2 聚為一類。而魯花1 4 ，中花2 號(hào)，梧油6 號(hào)，以及T W 0 4 各為一類。表明在D N A 水平上可以分析花生品種之間的親源關(guān)系。以長葉榧幼葉為材料，研究結(jié)果表明最佳的R A P D 反應(yīng)體系為：1 5u l反應(yīng)體系中含5 0 m m o l 幾K C l 、1 0 m m o I ／L T r i s - H C I ( p H 9 ．o ) 、O ．1 ％T r i t o n 一1 0 0 、2n

7、 m o l ／u lM g C l 2 、0 ．6 n m o l ／u ld N T P s 、0 ．7 5U T a q 酶、3 0 n g 引物以及1 0 0 n g左右的長葉榧基因組D N A 。利用1 8 個(gè){ f 物對(duì)來自3 個(gè)不同居群的6 6 個(gè)長葉榧樣本進(jìn)行分析。結(jié)果表明長葉榧種群水平的多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)：8 6 ．9 3 ％，居群水平的多態(tài)位點(diǎn)百分率為：8 3 ％、6 8 ％和8 0 ％。種群水平的N e i 氏基因多

8、樣性指數(shù)為：O ．2 4 7 9 ，居群水平的N e i 氏基因多樣性指數(shù)分別為：將石自然保護(hù)區(qū)長葉榧居群O ．2 1 8 2 、許坊埂長葉榧居群O ．1 6 8 4 、許坊水庫長葉榧居群O ．1 8 8 1 。S h a n n o n信息指數(shù)的分析結(jié)果與之相符，說明了長葉榧仍保留有較高的遺傳多樣性。長葉榧居群間的變異量占總的3 0 ．3 5 ％，居群內(nèi)的變異占總的6 9 ．6 3 ％，居群間的變異量較小與基因分化系數(shù)G s t 雨J