1、地錦(Parthenocissus tricuspidata Planch.)是城市垂直綠化中重要的攀緣木本植物之一,因其生長(zhǎng)迅速、攀緣力強(qiáng)、夏葉濃綠、秋葉紫紅、適應(yīng)性廣,在世界上應(yīng)用極為普遍,主要用于樓房墻體,道路坡面等的垂直綠化。目前,國(guó)內(nèi)外最常栽培該屬植物還有五葉地錦(Parthenocissus quinquefolia Planch.),它與地錦相比抗性強(qiáng)、生長(zhǎng)快,但吸盤不發(fā)達(dá),附著力較差。為了創(chuàng)造地錦屬新的種質(zhì)資源,豐富垂直

2、綠化的植物材料,需對(duì)地錦特有性狀如耐鹽堿和抗干旱性能、生長(zhǎng)速度等進(jìn)行遺傳改良,但是由于五葉地錦和地錦的種間不親和使得通過(guò)傳統(tǒng)有性雜交進(jìn)行地錦遺傳改良未能成功,現(xiàn)代植物生物技術(shù)的應(yīng)用為地錦的遺傳改良提供了新方法。
　　 圍繞利用生物技術(shù)提高地錦耐鹽堿性能這一目標(biāo),本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,首先以地錦葉柄為外植體,建立了有效的地錦葉柄體胚發(fā)生途徑的植株再生體系,并獲得了胚性愈傷組織。其次,長(zhǎng)期保存了地錦的胚性愈傷組織,并從胚性愈傷組

3、織誘導(dǎo)大量體胚發(fā)生和植株再生,提高了地錦體胚再生頻率；在此基礎(chǔ)上,以胚性愈傷為轉(zhuǎn)化受體,通過(guò)衡量抗性愈傷組織率的高低,對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)GUS報(bào)告基因轉(zhuǎn)化地錦遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素進(jìn)行了研究,建立了地錦胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系,為耐鹽目的基因轉(zhuǎn)化奠定了一定的基礎(chǔ)。另外,以胚性愈傷組織為外植體,利用組織培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生的體細(xì)胞變異來(lái)篩選耐鹽的愈傷組織和體胚,并在含NaCl的培養(yǎng)基上獲得地錦耐鹽再生植株。本研究的主要研究結(jié)果如下:
　　 1

4、.以地錦無(wú)菌苗40d齡的葉柄為外植體,建立了地錦葉柄體胚發(fā)生途徑的植株再生體系,并成功地獲得了胚性愈傷組織。研究結(jié)果表明:將葉柄接種在B5+0.5-2.0mg/L2,4-D+500mg/LCH+0.1g/LAC的培養(yǎng)基,不同的基因型均可以誘導(dǎo)胚性組織,然后將胚性組織接種在B5+1.0-2.0mg/LBA+0.1-0.3mg/LNAA+500mg/LCH的培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)體胚產(chǎn)生。90％的正常體胚在不加激素的MS培養(yǎng)基上均可一次性長(zhǎng)成根莖葉

5、完整的植株,畸形胚在MS+1.0mg/LBA+0.01mg/LNAA+500mg/LCH的培養(yǎng)基中可先誘導(dǎo)芽后在1/2MS+0.5mg/LIBA上誘導(dǎo)根的形成,不同基因型形成體胚和再生植株的能力存在顯著性差異。通過(guò)組織切片技術(shù),觀察了地錦體胚發(fā)生過(guò)程中的不同形態(tài)的胚性培養(yǎng)物和體胚,證實(shí)了地錦植株再生過(guò)程是經(jīng)過(guò)體胚發(fā)生途徑進(jìn)行再生。將根系發(fā)育完好的再生植株移栽后,植株生長(zhǎng)和外觀形態(tài)表現(xiàn)正常。
　　 2.探討了胚性愈傷組織長(zhǎng)期保存的

6、方法,并從長(zhǎng)期繼代的胚性愈傷組織中誘導(dǎo)了大量的體胚,提高了體胚再生頻率。此外,利用ISSR標(biāo)記分析了再生植株的變異情況。結(jié)果表明,在MS+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LNAA+500mg/LCH培養(yǎng)基上,在弱光照培養(yǎng)條件下,胚性愈傷組織能快速增殖并保持較好的胚胎發(fā)生能力。培養(yǎng)基中添加適量的BA與生長(zhǎng)素(NAA或2,4-D)可促使長(zhǎng)期繼代的胚性愈傷組織形成體胚,形成體胚的數(shù)目最高可達(dá)61/gFW(鮮重FreshWeight),I

7、SSR分析結(jié)果表明再生過(guò)程中存在體細(xì)胞變異。
　　 3.通過(guò)對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)地錦胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的諸多影響因素如農(nóng)桿菌菌株、共培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌侵染液濃度、侵染時(shí)間和AS的濃度等進(jìn)行比較研究,建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)地錦胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系。研究結(jié)果表明:菌株EHA105與菌株C58相比具有較強(qiáng)的侵染力,胚性愈傷組織侵染最適宜的農(nóng)桿菌菌液濃度為OD600=0.7,侵染時(shí)間為40min,4d共培養(yǎng)時(shí)間和在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加100μM

8、AS有利于提高轉(zhuǎn)化效率,利用這些參數(shù)能使抗性愈傷組織率達(dá)到42.6％左右。GUS組織化學(xué)染色、PCR分析和Southern雜交證實(shí)外源GUS報(bào)告基因已整合到轉(zhuǎn)化植物基因組中。
　　 4.利用組織培養(yǎng)技術(shù)篩選耐鹽愈傷組織并獲得了耐鹽植株。首先探討了不同NaCl濃度對(duì)地錦胚性愈傷組織增殖的影響,發(fā)現(xiàn)NaCl對(duì)胚性愈傷組織的增殖、存活率和愈傷的狀態(tài)都有極大的影響,確定了鹽半致死濃度和致死濃度分別為10g/L和20g/L,隨后通過(guò)篩選耐