1、蠟梅原名黃梅，是蠟梅科蠟梅屬的落葉叢生灌木。蠟梅起源古老，種類較少，是第三紀孑遺植物和國家二級珍稀瀕危植物。蠟梅是中國的傳統(tǒng)名花，也是常用的園林綠化植物，它與梅花、山茶、水仙一起被稱為“雪中四友”。蠟梅不僅具有較高的觀賞性，還能作為經(jīng)濟植物、環(huán)保植物和藥用植物被人們加以利用。雖然蠟梅的栽培歷史悠久，但對它的開發(fā)研究利用主要是從20世紀80年代開始，且主要集中在國內，研究范圍從宏觀的種質資源、形態(tài)分類到微觀的細胞學和分子生物學等內容均有涉

2、及。近年來植物離體培養(yǎng)和遺傳轉化技術的發(fā)展，更為蠟梅的開發(fā)利用提供了新的途徑。蠟梅常用的繁殖方法有嫁接、分株和播種繁殖，但這些常規(guī)繁殖技術要求嚴格，繁殖系數(shù)較低。通過離體培養(yǎng)，不僅可以對蠟梅能進行快繁及種質資源保存，同時也能為蠟梅的基因工程奠定基礎。但相對于草本植物，木本植物的組培研究起步較晚并且不夠深入，通過組培進行規(guī)?；a(chǎn)的樹種還比較少。作為一種木本花卉植物，蠟梅的組織培養(yǎng)存在著一定難度，比如它的再生分化比較困難，在組培過程中容易

3、褐化等。而通過研究和建立蠟梅的遺傳轉化體系，則可以打破常規(guī)育種的限制，縮短育種年限，對蠟梅的抗性以及花色、花形等性狀進行改良，培育出新品種，從而使蠟梅這一古老植物煥發(fā)出新的光彩。 目前國內有關蠟梅的組培報道主要集中在探索它的快繁技術上，未見通過分化建立蠟梅再生體系的報道，有關蠟梅遺傳轉化體系建立的研究也沒有報道。本實驗旨在采用蠟梅無菌苗子葉作為外植體誘導愈傷組織的形成與分化，并以此為基礎初步建立并優(yōu)化蠟梅的遺傳轉化體系。

4、 (1)蠟梅的離體培養(yǎng)以蠟梅種子無菌苗子葉作為外植體，以改良MS和MS作為基本培養(yǎng)基，添加不同激素組合，篩選出誘導蠟梅愈傷組織產(chǎn)生和分化的最佳培養(yǎng)基，建立起蠟梅的再生體系。將種子無菌苗半展開的子葉切成1 cm×1 cm的方塊，接種于誘導培養(yǎng)基上進行愈傷組織的誘導和分化，再將分化出的芽切下接種于增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，待苗長到3～4 cm高時，切掉基部愈傷，接于生根培養(yǎng)基中生根。實驗結果表明，改良MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0

5、.5 mg/L+KT0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L+2，4-D0.2 mg/L能誘導蠟梅愈傷組織的產(chǎn)生和分化，分化率為11.7％；再生植株在改良MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L上增殖系數(shù)最高，能達到2.7：1/2MS+NAA0.1 mg/L能有效促進蠟梅生根，生根率在80％以上，而在未添加激素的1/2MS中蠟梅生根緩慢，生根率僅為10％。 (2)蠟梅遺傳轉化體系的初步建立及優(yōu)化以蠟梅的愈傷組織作為外植體，

6、確定Cef,Km的篩選壓，并利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化法將GUS基岡轉入蠟梅愈傷組織之中，初步建立起蠟梅的遺傳轉化體系。通過GUS基因瞬時表達的檢測，探討了農桿菌菌液濃度，侵染時間，不同類型侵染液，侵染液中AS的添加以及共培養(yǎng)時間對蠟梅轉化的影響。結果表明以上因素是農桿菌介導的蠟梅遺傳轉化的重要影響因子。在農桿菌EHA105-pIG121介導轉化蠟梅的體系中，Cef的篩選壓為200mg/L，Km的篩選壓為35 mg/L，優(yōu)化后的轉化方

7、法為：將蠟梅愈傷組織切成1 cm×1cm大小，在培養(yǎng)基改良MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L+2，4-D0.2 mg/L上黑暗預培養(yǎng)3d。將第二次活化后OD<,600>值為0.4的農桿菌菌液離心后收集菌體，加入液體MS+AS100μmol/L，重懸到OD<,600>為0.4。將預培養(yǎng)后的愈傷組織置于重懸后的菌液中，在搖床上振蕩侵染10min，在超凈工作臺上用滅菌濾紙將愈傷

8、組織表面菌液吸干，再次接種于培養(yǎng)基改良MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.5mg/L+IBA0.2 mg/L+2，4-D0.2 mg/L中黑暗共培養(yǎng)2d。2d左右愈傷組織周圍開始出現(xiàn)菌斑，此時，將愈傷組織放于液體MS+Cef1000 mg/L中脫菌2h，然后用無菌水沖洗愈傷5次，放于滅菌紙上將水吸干，然后接種于改良MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.5mg/L+IBA0.2 mg/L