1、本文構(gòu)建了咖啡堿合成酶基因干涉表達(dá)載體，以茶樹(shù)(Cxmelliasinensiscv.)龍井-43組培苗葉片為外植體，研究了影響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系因素。根據(jù)GUS染色情況，對(duì)影響農(nóng)桿菌侵染茶樹(shù)葉片效果的若干參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以期為低咖啡堿茶樹(shù)品種培育提供一條新的途徑。檢測(cè)了野葛愈傷組織提取物清除自由基能力和抗氧化活性，為開(kāi)發(fā)新型天然抗氧化劑提供了試驗(yàn)依據(jù)。
　　 1.咖啡堿合成酶(Teacaffeinesynthase，

2、TCS)基因RNAi載體的構(gòu)建
　　 咖啡堿合成酶(TCS)是茶樹(shù)咖啡因生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，故抑制TCS基因表達(dá)可以有效抑制茶樹(shù)中咖啡堿的合成，是培育低咖啡因茶樹(shù)的有效途徑。以龍井-43組培苗葉片為材料，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)咖啡堿合成酶保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用RT-PCR克隆到一350bp的cDNA序列。根據(jù)序列設(shè)計(jì)兩對(duì)分別加有不同酶切位點(diǎn)的正、反基因的特異上下游引物，擴(kuò)增出TCS保守區(qū)域的正、反義片斷。

3、將TCS反義片斷、副球菌中類(lèi)胡蘿卜素合成有關(guān)的間隔基因YYT(GenBankwithaccessionnumberAY345165)以及TCS正義片斷串聯(lián)在一起，克隆到T載體。經(jīng)測(cè)序鑒定后，雙酶酶切下目標(biāo)片斷并插入到表達(dá)載體PCMBIA1301中，構(gòu)建TCS基因的RNAi載體。
　　 2.茶樹(shù)根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化
　　 以茶樹(shù)龍井-43組培苗葉片為轉(zhuǎn)化受體，根據(jù)GUS表達(dá)情況優(yōu)化了茶樹(shù)根癌農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化參數(shù)。結(jié)果表

4、明，葉片預(yù)培養(yǎng)3d后用濃度OD600為0.8的菌液侵染10min，共培養(yǎng)4天，能夠達(dá)到比較好的轉(zhuǎn)化效果，15天后GUS表達(dá)率為63.3％。同時(shí)對(duì)龍井-43組培苗葉片進(jìn)行了潮霉素敏感實(shí)驗(yàn)，篩選出茶樹(shù)葉片農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化中潮霉素的選擇壓濃度為40mg·L-1。
　　 3.野葛愈傷組織提取物清除自由基活性
　　 采用1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH·)的有機(jī)自由基體系以及羥自由基和超氧陰離子自由基兩種無(wú)機(jī)活性氧自由基體系，以野葛

5、根提取物作為對(duì)照，對(duì)野葛愈傷組織提取物的體外清除自由基和抗氧化活性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：野葛愈傷組織提取物對(duì)DPPH·清除作用與野葛根提取物相當(dāng)，而對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用則弱于野葛根提取物。在濃度為0.2mg·mL-1時(shí)，野葛愈傷組織提取物清除O2-·能力較強(qiáng)，顯著優(yōu)于野葛根提取物，而對(duì)鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的抑制能力則與野葛根提取物相當(dāng)。當(dāng)濃度達(dá)到1.0mg·mL-1時(shí)，野葛愈傷組織提取物清除O2-·的能力與野葛根提取物相當(dāng)，而對(duì)