1、由柑橘衰退病毒（Citrustristezavirus，CTV）引起的柑橘衰退病是影響柑橘生長(zhǎng)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害。CTV為長(zhǎng)線形病毒科（Closteroviridae）長(zhǎng)線形病毒屬（Closterovirus）的成員，已知存在明顯CTV株系分化和多個(gè)基因型，目前有關(guān)基因型鑒定方法和我國CTV分離物的基因型組成信息仍亟待完善。該病毒具有兩個(gè)衣殼蛋白組分，即CP和CPm，二者除為結(jié)構(gòu)蛋白外，還具有多種重要的生物學(xué)功能。深入研究CP和CPm

2、的遺傳變異和抗原特性可為探究CTV的系統(tǒng)進(jìn)化特點(diǎn)及解析其生物學(xué)特性等提供重要信息。本研究對(duì)來源于我國部分地區(qū)CTV分離物的基因型組成、群體遺傳結(jié)構(gòu)以及CP的抗原表位特性進(jìn)行了深入研究，取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.我國CTV分離物的基因型研究
　　以采自湖北和江西兩省的10個(gè)CTV分離物為對(duì)象，采用已報(bào)道的11個(gè)基因型多重分子標(biāo)記引物(VTK17、VTPOL、VT-5'、T3K17、T30K17、T30POL、T30-5

3、'、T36K17、T36POL、T36-5'和B165-LProⅡ)對(duì)其進(jìn)行多重分子標(biāo)記(MMM)RT-PCR分析，結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，我國CTV種群中，除了已知的4種基因型(VT、T36、T30和T3)，首次鑒定出B165和RB基因型。而且在我國CTV分離物中多種基因型混合侵染的現(xiàn)象較普遍，僅發(fā)現(xiàn)三個(gè)分離物N4、S4和BX為單一基因型侵染。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因組5'端的分子標(biāo)記引物特異性較高，可較好區(qū)分相應(yīng)的基因型，而

4、位于POL和K17區(qū)域的分子標(biāo)記特異性較低，不能特異區(qū)分VT和T3、VT和T30以及T30和RB基因型。對(duì)K17、POL和LProⅡ區(qū)域進(jìn)行氨基酸多重比對(duì)分析的結(jié)果表明，存在基因型特異性氨基酸位點(diǎn)。S45-VTPOL序列雖與T36聚為一大支，但與T36相似性僅89.7％。類似地，B15-LProⅡ和B16-LProⅡ序列與B165聚為一支，但與參考分離物B165相似性很低，核苷酸和氨基酸水平分別介于70.0-81.8％和67.1-76.

5、6％，重組分析未從這些序列中檢測(cè)到重組事件，表明我國CTV種群可能存在新的基因型。此外，發(fā)現(xiàn)MMM與標(biāo)記序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果存在不一致情況，因此基因型的鑒定需采用MMM-RT-PCR與序列分析相結(jié)合。
　　2.CP和CPm基因的遺傳多樣性和進(jìn)化特點(diǎn)研究
　　從我國4個(gè)主要柑橘產(chǎn)區(qū)（湖南、四川、江西和湖北省）收集柑橘葉片或枝條樣品共計(jì)85份，其中6份湖北樣品為已知陽性樣品，四川樣品均表現(xiàn)衰退癥狀。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，CT

6、V總體檢出率為32.8％(26/79)，而四川樣品CTV檢出率達(dá)100％(11/11)。采用引物CPm(F)和T36-CP(R)對(duì)32份陽性CTV樣品進(jìn)行擴(kuò)增，從29份樣品克隆到了含有部分p61基因、完整CPm和CP基因以及兩者中間非編碼間隔區(qū)的大片段(～1540bp)。序列分析表明各分離物之間和內(nèi)部均表現(xiàn)較高的遺傳多樣性?；?540bp片段核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果表明，我國CTV分離物可以劃分為6組，除已報(bào)道的5個(gè)組群(RB

7、、T30、T36、HA和VT)，新鑒定出僅含中國分離物的組群(Ⅵ)。來自湖南樣品的CTV分離物多為RB（克服枳殼抗性）組群，而在VT組群內(nèi)存在一以中國蚜傳分離物AT-1為代表的中國特有亞群，該亞群分離物相比其他所有分離物，P61蛋白C端均特異插入了一個(gè)氨基酸位點(diǎn)，將該亞群命名為AT-1。分別采用CP和CPm基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹具有類似拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但有的組群或分離物在兩系統(tǒng)進(jìn)化樹中位置有變化。在CPm系統(tǒng)進(jìn)化樹中，T30基因型組群

8、的分離物聚在RB組群，形成單一亞組RB-d，與其他3個(gè)RB亞組的遺傳距離較近，介于0.024±0.005～0.037±0.005。對(duì)1540bp片段序列進(jìn)行重組分析，結(jié)果表明CPm基因是CTV基因組的重組熱點(diǎn)區(qū)域之一，在該區(qū)域共計(jì)檢測(cè)到25個(gè)重組事件，而CP基因內(nèi)僅檢測(cè)到2個(gè)重組事件?；蚱品治霰砻魑覈c其他國家或地區(qū)的CTV分離物存在明顯的基因交流，且全球CTV分離物CP群體處于明顯擴(kuò)張趨勢(shì);自然選擇分析表明CP和CPm基因均處于負(fù)

9、向選擇壓力下;此外，從兩個(gè)基因內(nèi)部分別發(fā)現(xiàn)新的正向選擇密碼子，包括位于CPm基因的第9位密碼子和位于CP基因的第31、41和68位密碼子。以上結(jié)果表明基因漂移、基因重組和負(fù)向選擇壓力是我國CTV復(fù)雜種群形成的主要原因。
　　3.CTV-AT-1分離物基因組全長(zhǎng)的克隆和序列分析
　　AT-1為通過蚜傳獲得的亞分離物，對(duì)其全基因組進(jìn)行了測(cè)序，大小為19，252bp(GenBankAccessionNo.JQ061137)。CPH

10、inf(Ⅰ)/RFLP結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析表明，該分離物屬于VT基因型和RFLP第Ⅲ組群，為我國優(yōu)勢(shì)組群，且為單一侵染?；蚪M序列分析表明，AT-1與VT組群的T318A分離物相似性最高，為96.8％，并聚為一支，與屬于T36組群的Qaha和Mexico兩個(gè)分離物相似性最低，均為80.9％。各開放閱讀框和兩端非編碼區(qū)相似性分析表明，在5'-UTR和3'-UTR區(qū)分別與參考分離物VT和B165的相似性最高，為98.1％和98.9％;在12

11、個(gè)開放閱讀框中，5'端ORF1a和RdRp的核苷酸序列均與參考分離物VT相似性最高，而其氨基酸序列分別與參考分離物T30和T3具有最高相似性;3'端除p6外的9個(gè)基因在核苷酸和氨基酸水平上均與B165分離物相似性最高。重組分析進(jìn)一步確認(rèn)AT-1為VT和B165的重組子，且重組位點(diǎn)位于RdRp和p33之間。
　　4.CTVCP的抗原表位作圖和定點(diǎn)突變分析
　　隨機(jī)選取10株CTV特異性單克隆抗體，以CTV-S4分離物CP為對(duì)象

12、，采用蛋白截短法結(jié)合Westernblotting分析，鑒定出7株單克隆抗體識(shí)別的3個(gè)抗原表位區(qū)域。其中MAb5和6識(shí)別表位區(qū)域Ⅰ（48LGTQQNAALNRDLFLT63），MAb3和7識(shí)別表位區(qū)域Ⅲ(114LSDKLWTDVVFN125)，MAb1、4和10識(shí)別表位區(qū)域Ⅱ(97DDDSTGIT104)，該區(qū)域?yàn)樾妈b定的抗原表位區(qū)域。采用合成多肽（97DDDSTGIT104、97DDDSTGI103和97DDDSTG102）和ELIS

13、A分析，進(jìn)一步確認(rèn)表位區(qū)域Ⅱ?yàn)镸Ab1、4和10的識(shí)別區(qū)域，且C端氨基酸T104和I103的缺失對(duì)表位識(shí)別具有顯著影響。不同CTV分離物CP基因編碼氨基酸多重比對(duì)分析表明，該區(qū)域高度保守。定點(diǎn)突變分析表明，該區(qū)域的突變會(huì)一定程度上影響抗體對(duì)表位Ⅱ的識(shí)別，其中I103M和S100T突變會(huì)顯著降低MAb1、4和10對(duì)表位Ⅱ的識(shí)別能力。
　　5.CTV-HB1CP與單克隆抗體互作的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的鑒定和表位結(jié)構(gòu)分析
　　采用上述1

14、0株單克隆抗體對(duì)CTV-HB1病毒粗提液和CP基因原核表達(dá)蛋白進(jìn)行Westernblotting分析，結(jié)果表明5株單抗（MAb1、4、5、6和10）不能識(shí)別。CP基因編碼氨基酸序列的多重比對(duì)分析表明，位于表位區(qū)域Ⅱ的第98位點(diǎn)在除HB1外的所有CTV分離物中高度保守，均為天冬氨酸(D98)，而HB1為甘氨酸(G98)。將S4-CP的D98突變?yōu)镚98，MAb1、4和10不能識(shí)別表位Ⅱ，表明D98為這3個(gè)單抗識(shí)別大多數(shù)CTV分離物的重要位

15、點(diǎn)。進(jìn)一步回復(fù)突變（將HB1-CP的G98突變?yōu)镈98）可以導(dǎo)致這3個(gè)單抗重新識(shí)別HB1CP，表明G98是HB1CP與這3個(gè)單抗互作的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。CTV-S4和CTV-HB1兩個(gè)分離物CP之間的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和比較分析表明，氨基酸位點(diǎn)G98暴露的表面積區(qū)域過小可能是不能識(shí)別的主要原因。CTV-HB1和CTV-S4在MAb5和6識(shí)別的表位區(qū)域Ⅰ(aa48-63)的序列相同，結(jié)合結(jié)構(gòu)分析，可能構(gòu)象變化是CTV-HB1CP不能被這兩個(gè)單抗識(shí)別的