1、豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起豬的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。在過去30年間，雖然PEDV常規(guī)疫苗被廣泛應(yīng)用，但是PED在各國豬場中的感染仍然非常嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。所以，關(guān)于PEDV的新型疫苗、侵入機(jī)制和免疫機(jī)理的研究是十分必要的。眾所周知，病毒的抗原表位、受體與受體結(jié)合域在病毒侵染和抗

2、病毒免疫中起著重要作用。S蛋白是PEDV一個(gè)表面的結(jié)構(gòu)蛋白，它既含有介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞的受體結(jié)合域，又擁有介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體的抗原表位。鑒于此，本研究對(duì)PEDVS蛋白的抗原表位和受體結(jié)合域進(jìn)行篩選與鑒定，為PEDV診斷方法和新型疫苗的研究以及抗病毒免疫策略的設(shè)計(jì)提供信息。 為獲得PEDVS基因及其分子特性，本試驗(yàn)克隆了PEDVCV777毒株細(xì)胞適應(yīng)毒的S基因，序列比對(duì)結(jié)果表明，獲得的S基因與PEDVCV777毒株S基因參

3、考序列核苷酸的同原性為99.4％，推導(dǎo)氨基酸的同原性為99.8％。S蛋白氨基酸的疏水性、信號(hào)肽序列和N-側(cè)鏈連接糖基化位點(diǎn)分析表明，克隆的S基因保持了其親本毒株CV777S基因的分子特性。根據(jù)冠狀病毒Ⅱ群成員S蛋白S1和S2亞基之間的保守基序(GxCx和保守九肽)，PEDVS蛋白可以被劃分為2個(gè)功能區(qū)即S1(第1～789位氨基酸)和S2(第790～1383位氨基酸)，其中S1區(qū)包含了病毒主要的中和表位和受體結(jié)合域。 為了分析S蛋

4、白S1區(qū)抗原表位特征，利用fd絲狀噬菌體展示系統(tǒng)，構(gòu)建了S1基因特異性肽庫，以PEDV多克隆血清為靶蛋白對(duì)構(gòu)建的肽庫進(jìn)行3輪生物淘選，結(jié)果獲得了3個(gè)高親和力序列，分別命名為S1P1(第248～280位氨基酸)、S1P2(第442～499位氨基酸)和S1P3(第697～742位氨基酸)。ELISA和Westernblot結(jié)果顯示，S1P1、S1P2和S1P3的GST融合蛋白均與PEDV多克隆血清反應(yīng)，其中S1P3反應(yīng)性最強(qiáng)。為了進(jìn)一步揭示

5、S1P1、S1P2和S1P3短肽的抗原性，三個(gè)短肽GST融合蛋白和它們串聯(lián)后GST融合蛋白(S1P123-GST)的單因子鼠血清被制備。間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和ELISA結(jié)果證實(shí)，抗S1P2、S1P3和S1P123GST融合蛋白的單因子鼠血清能識(shí)別天然的PEDV。本試驗(yàn)結(jié)果表明，S1P1、S1P2和S1P3是PEDVS蛋白3個(gè)線性抗原表位，S1P2和S1P3表位具有良好的免疫原性。 PEDVS蛋白S1區(qū)在介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生過程

6、中發(fā)揮重要作用。為了鑒定S蛋白S1區(qū)的免疫優(yōu)勢區(qū)，利用PCR擴(kuò)增了4個(gè)相互重疊、覆蓋S1基因的片段，分別命名為S1A、S1B、S1C和S1D。四個(gè)片段PCR產(chǎn)物分別克隆到pGEX-6p-1原核表達(dá)載體后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)均獲得了表達(dá)。Westernblot和ELISA結(jié)果顯示，S1D-GST融合蛋白(第636～789位氨基酸)與PEDV的多克隆抗體具有強(qiáng)反應(yīng)性。IFA和Westernblot結(jié)果表明，抗S1D-GST融合蛋白的鼠血清能夠識(shí)

7、別天然的S蛋白。病毒中和試驗(yàn)表明，S1D-GST融合蛋白能介導(dǎo)鼠產(chǎn)生對(duì)PEDV具有中和作用的抗體。為了對(duì)中和表位區(qū)(S1D)的抗原表位進(jìn)行精確定位，制備并獲得了6株抗S1D特異性的單克隆抗體，Westernblot結(jié)果顯示，6株單克隆抗體均能識(shí)別天然的S蛋白。利用噬菌體展示和肽掃描技術(shù)對(duì)6株單克隆抗體識(shí)別的表位進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示，單克隆抗體2C4、3C3和5F8識(shí)別的表位是S蛋白的第744～759位氨基酸(S1D5)，單克隆抗體3G3

8、、6E6和3G5識(shí)別的表位是S蛋白的第756～771位氨基酸(S1D6)。ELISA和IFA結(jié)果表明，抗S1D5和S1D6表位融合蛋白的鼠血清均能識(shí)別天然的S蛋白。進(jìn)一步的肽掃描(Pepscan)結(jié)果顯示，S1D5表位的核心序列是Y748SNIGVCK755(SS5)，S1D6表位的核心序列是L764QDGQVKI771(SS6)。 病毒細(xì)胞受體和受體結(jié)合域的信息能為病毒疫苗和抗病毒藥物設(shè)計(jì)提供策略。為了揭示PEDV的受體結(jié)合域

9、信息，本試驗(yàn)以PEDV可溶性的細(xì)胞受體豬氨基肽酶N(pAPN)為靶蛋白對(duì)S1基因特異性肽庫進(jìn)行3輪生物淘選，然后對(duì)30個(gè)淘選的噬菌體克隆進(jìn)行測序。序列分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)噬菌體克隆展示無義氨基酸序列，其余28個(gè)噬菌體克隆展示的氨基酸序列位于S蛋白第249～529位氨基酸區(qū)域，這個(gè)區(qū)域被命名為MRR。為了進(jìn)一步印證MRR區(qū)與PAPN在體外的相互作用，利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)MRR基因進(jìn)行真核表達(dá)。Westernblot結(jié)果表明

10、，表達(dá)的MRR重組蛋白能夠與兔抗PEDV的多克隆抗體反應(yīng)。但是，進(jìn)一步的pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用抗pAPN的鼠血清通過Westernblot檢測不到與MRR重組蛋白結(jié)合的pAPN。本試驗(yàn)結(jié)果提示，PEDVS蛋白第249～529位氨基酸區(qū)域(MRR)是pAPN細(xì)胞受體的一個(gè)潛在的結(jié)合區(qū)域。 本研究鑒定出PEDVS蛋白5個(gè)線性抗原表位即S1P1(第248～280位氨基酸)、S1P2(第442～499位氨基酸)、S1P3(