1、冠狀病毒在系統(tǒng)分類上屬尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)。它是有包膜的單股正鏈RNA病毒，在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制。經(jīng)歷過2003年中國爆發(fā)的SARS，人們開始對(duì)冠狀病毒廣泛關(guān)注。2013年中東國家和地區(qū)爆發(fā)一種新型冠狀病毒MERS-CoV引起的SARS病癥，患者死亡率高達(dá)50％，再一次引起世人對(duì)冠狀病毒的廣泛關(guān)注。而PEDV屬于α類冠狀病毒，只有一個(gè)血清型。2010年

2、我國境內(nèi)爆發(fā)豬流行腹瀉病毒(下文簡稱為PEDV)，它的基因組包括ORF1a/b-S-ORF3-E-M-N，基因ORF1a/b和ORF3分別編碼復(fù)制酶多聚蛋白和附屬蛋白兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，而基因S、E、M和N分別編碼纖突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣殼蛋白。PEDV的細(xì)胞嗜性主要是由Spike蛋白（即S蛋白）決定的，同時(shí)S蛋白的S1區(qū)也包含了病毒主要的中和表位。PEDV的受體是pAPN，pAPN是150kDa的糖基化的跨膜蛋白，在小腸粘膜上高表

3、達(dá)。PEDV的S蛋白是高度糖基化的，含有21-35個(gè)N糖基化位點(diǎn)。S蛋白在病毒表面上組裝成三聚體形成明顯的“冠”。大多數(shù)研究都把S蛋白劃分成S1區(qū)和S2區(qū)，S1區(qū)域包含受體結(jié)合域(RBD)，S2區(qū)域含有兩個(gè)七肽重復(fù)區(qū)（HR1和HR2），認(rèn)為S1區(qū)域負(fù)責(zé)與細(xì)胞受體結(jié)合，而S2區(qū)域負(fù)責(zé)膜融合。冠狀病毒進(jìn)入細(xì)胞也有自己的一套機(jī)制，早在2003年Bosch等人就鑒定了冠狀病毒的S蛋白為Ⅰ型融合蛋白，2008年JudithM.White等人按照結(jié)

4、構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)確定了三種明顯不同的病毒膜融合蛋白（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型融合蛋白），以及至少四種不同的激發(fā)病毒融合蛋白經(jīng)歷融合而導(dǎo)致構(gòu)象變化的機(jī)制，總結(jié)了各種特征的病毒融合蛋白經(jīng)歷“完全融合狀態(tài)→嵌膜的同源三聚體發(fā)卡前體→三聚體發(fā)夾”的轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)病毒膜與宿主細(xì)胞膜的融合，而冠狀病毒的S蛋白也同樣通過這種策略調(diào)節(jié)融合。PEDV的細(xì)胞培養(yǎng)比較困難，目前學(xué)界得到的PEDV細(xì)胞培養(yǎng)株只有7株，而且這些毒株適應(yīng)Vero細(xì)胞的分子基礎(chǔ)尚不得而知，一些初步的研究

5、結(jié)果提示S基因堿基或氨基酸的突變可能是潛在的PEDV適應(yīng)細(xì)胞的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)。2013年，我們課題組與荷蘭烏德勒支大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院合作，利用PEDV與MHV間S基因胞外區(qū)的替換，成功構(gòu)建了基于RNATargetedrecombination方法的PEDV反向遺傳學(xué)操作平臺(tái)，為本課題的順利實(shí)施奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此，本論文利用該操作系統(tǒng)，用DR13毒株非細(xì)胞適應(yīng)株(Genbank:JQ023161)的S基因，分別逐段替換DR13細(xì)胞適應(yīng)株(Ge