1、在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中，胚胎細胞第一次分化形成內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)外胚層。滋養(yǎng)層干細胞（trophoblast stem cells，TSC）是胎盤細胞的前體細胞，在胎盤發(fā)育中有重要作用。有蹄類滋養(yǎng)層干細胞的建系是公認的難點，目前僅在山羊、牛、豬等有蹄類動物獲得滋養(yǎng)層細胞的報道，但這些研究并沒有對這些細胞系多潛能性或干細胞的特征進行全面鑒定。因此這些細胞系可能處于有別于TSC的分化階段。本研究比較了不同培養(yǎng)體系對牛類滋養(yǎng)層干細胞(bovin

2、etrophoblast stem-like，bTS)建系的影響，特別對利用2i(PD0325901和CHIR99021)獲得的牛類滋養(yǎng)層干細胞bTS進行了鑒定，包括堿性磷酸酶檢測、核型分析、干細胞多能性標志物基因表達情況和分化潛能的檢測，以確定bTS是否為典型的牛類滋養(yǎng)層干細胞。我們采用寡聚核苷酸芯片檢測了約23000個牛的轉(zhuǎn)錄物，還分別對干細胞多潛能性轉(zhuǎn)錄因子OCT4、NANOG、SOX2、CDX2基因的啟動子區(qū)域甲基化情況進行了初

3、步分析。主要研究成果如下:
　　1不同的培養(yǎng)體系對牛類滋養(yǎng)層干細胞培養(yǎng)和建系的影響
　　以DMEM/F12+ Neurobasal Medium+N2B27或單獨使用DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加2i、FGF或Wnt3a，分別以L Wnt-3A/MEF混合細胞或BFF作為飼養(yǎng)層，探討不同的培養(yǎng)體系對牛滋養(yǎng)層干細胞培養(yǎng)和建系的影響。結(jié)果表明:2i培養(yǎng)液結(jié)合L Wnt-3A/MEF和添加Wnt3a的2i培養(yǎng)液結(jié)合BFF兩個

4、培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的bTS具有典型的類似小鼠TSC的形態(tài)，呈單層扁平生長，體外長期培養(yǎng)沒有明顯的形態(tài)變化，所建的細胞系最長已傳至170代;而在去除小分子PD0325901并添加FGF的培養(yǎng)體系，無論使用L Wnt-3A/MEF或BFF作為飼養(yǎng)層，細胞生長緩慢，雖然形態(tài)類似小鼠ESC，呈三維立體生長，但均未能傳過18代。
　　2 bTS細胞系滋養(yǎng)層干細胞基本特性的鑒定
　　本研究利用2i培養(yǎng)液結(jié)合L Wnt-3A/MEF所建立的細

5、胞系BTS-1具有正常的二倍體核型。在體外長期培養(yǎng)中，該細胞系保持了未分化狀態(tài)，堿性磷酸酶檢測呈陽性，表達干細胞多能基因OCT4、NANOG、SOX2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-1和SSEA-4。同時表達TSC標志基因CDX2、TEAD4、EOMES、ELF5、GATA3、SMARCA4(BRG1)、 ETS2和ERR2。bTS細胞體外可分化為類胚體或貼壁生長并形成雙核滋養(yǎng)層細胞。分化的細胞中檢測到滋養(yǎng)層分化標志物H

6、AND1、MASH2和PL-1表達上調(diào)。在畸胎瘤實驗中，bTS細胞能在NOD-SCID小鼠體內(nèi)產(chǎn)生胎盤滋養(yǎng)層細胞。我們認為bTS細胞具有滋養(yǎng)層干細胞的基本特征。此外，BTS-1細胞經(jīng)GFP慢病毒轉(zhuǎn)染并被DOX誘導(dǎo)后，14.81％的細胞能夠表達GFP。
　　3 bTS細胞系的基因表達寡聚核苷酸芯片分析和甲基化分析
　　在BTS-1中，有一些多潛能性基因表達水平低于其在囊胚中的表達水平，但高于它們在BFF中的表達水平，這一類基因

7、包括OCT4、SOX2、GDF3、KLF4、KLF5、SFRP2、SMAD3、SPARC、STAT3、TBX3和THAP11;在BTS-1細胞和囊胚中，TDGF、MYCN、CCR4、ALPL、SMAD2和SUZ12的表達水平相近，但它們在BTS-1的表達明顯高于BFF細胞;TFAP2A、ELF5、CYP11A1、PPARG、ID2、GCM1、HAND1和THAP11等TSC基因和TR基因在BTS-1細胞中表達很高;牛TR標志物基因，例如

8、TDK和PAG，在BTS-1細胞中有很強的表達。對4種干細胞關(guān)鍵基因的甲基化分析結(jié)果顯示:與囊胚相比，BTS-1細胞中OCT4、NANOG和SOX2的甲基化程度分別升高168％(P＜0.001)、120％(P＜0.05）和116％(P＜0.001)。CDX2發(fā)生了甲基化，但2個啟動子區(qū)域甲基化程度與囊胚相比分別降低27％(P＜0.5)和57.7％(P＜0.001)。與BFF細胞相比，BTS-1細胞中NANOG和SOX2的甲基化程度分別上