1、長(zhǎng)期以植物韌皮部汁液為食的稻飛虱,其體內(nèi)均存在內(nèi)共生菌。類酵母共生菌(Yeast-like symbiotes,YLS)是存在于稻飛虱體內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群,與稻飛虱的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖息息相關(guān)。已有研究證明,稻飛虱體內(nèi)不止存在一種類酵母共生菌,而且共生菌的數(shù)量隨著稻飛虱生長(zhǎng)環(huán)境的變化而變化。本實(shí)驗(yàn)以褐飛虱為研究對(duì)象,結(jié)合巢式 PCR和變性梯度凝膠電泳(DGGE)對(duì)類酵母共生菌18S rDNA和5.8S-ITS rDNA的部分序列進(jìn)行分析,不僅建立

2、了檢測(cè)褐飛虱體內(nèi)共生菌多樣性的方法,而且通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qPCR)和DGGE探知三種類酵母共生菌在不同蟲齡以及不同抗性水稻飼養(yǎng)下的褐飛虱體內(nèi)的變化規(guī)律。將得到的結(jié)果總結(jié)如下:
　　1.建立了巢式PCR-DGGE檢測(cè)褐飛虱體內(nèi)共生菌多樣性的方法:以NS1-NS8和NS5-ITS4作為外圍引物進(jìn)行巢式PCR的首輪擴(kuò)增,然后以此擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,NFGC/NR、ITS1FGC/ITS2和ITS1GC/ITS2為內(nèi)引物進(jìn)行目標(biāo)片段

3、的特異性擴(kuò)增。利用此方法不僅快速檢測(cè)到已經(jīng)報(bào)道的Noda菌、季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)、假絲酵母(Candida),還包括其他的真菌,例如Saccharomycetales sp., Debaryomyces hansenii和一些uncultured fungi。相對(duì)于傳統(tǒng)的菌種鑒定方法,此方法為我們提供一個(gè)比較全面的鑒定飛虱體內(nèi)類酵母共生菌種類的途徑,為飛虱體內(nèi)共生菌的多樣性的研究奠定基礎(chǔ)。

4、　　2.通過對(duì)三種類酵母共生菌(Noda菌、Pichia guilliermondii、Candida)在褐飛虱不同齡期中的拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn),Noda菌在褐飛虱各個(gè)齡期的數(shù)量均顯著高于其他兩種菌,再次驗(yàn)證Noda菌的數(shù)量在三種共生菌中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。另外對(duì)三種菌各自在褐飛虱不同齡期5組樣品中的變化規(guī)律分析發(fā)現(xiàn),三種菌呈現(xiàn)相近的變化規(guī)律,在4齡若蟲期之前,共生菌的數(shù)量均隨著蟲齡的增加而增加,在5齡若蟲期數(shù)量有顯著的下降趨勢(shì),而到成蟲期數(shù)量又有

5、顯著地回升。
　　3.利用DGGE和qPCR,分析Noda菌、Pichia guilliermondii和Candida三種類酵母共生菌在褐飛虱適應(yīng)抗性品種前八代的變化規(guī)律發(fā)現(xiàn):在適應(yīng)抗性品種的過程中數(shù)量急劇下降,在第二代時(shí)三種共生菌數(shù)量達(dá)到最低,到第三代時(shí),數(shù)量開始回升,之后趨于平緩。然而,在同一世代上的三種共生菌的數(shù)量變化不盡相同:Pichia guilliermondii和Candida在三種抗性水稻(ASD7、RH、Mud