1、定殖是根圍促生細菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）發(fā)揮促生和生防作用的重要前提條件之一。至今人們對PGPR在作物上定殖的了解多局限于定殖形態(tài)位置和定殖水平高低，對涉及的基因和分子機制知之甚少，在芽孢桿菌領域尤為如此。本研究從以下4個方面對芽孢桿菌在番茄根表定殖的機制進行探討。1）枯草芽孢桿菌OKB105在番茄根表定殖突變體篩選和定殖相關基因鑒定;2）Swarming是影響枯草芽孢桿菌

2、OKB105在番茄根表定殖的重要因素;3）yczE基因有助于芽孢桿菌營養(yǎng)細胞忍耐致死高溫和解淀粉芽孢桿菌FZB42 swarming運動;4）3株枯草芽孢桿菌在番茄根表的定殖動態(tài)以及對促生和生防效果的影響。主要研究結果如下:
　　 1)在進行定殖篩選之前，先對OKB105菌株突變體文庫中的600個突變體進行營養(yǎng)缺陷型篩選，從中剔除了11個營養(yǎng)缺陷型突變體。將剩余的589個突變體采用MS瓊脂無菌系統(tǒng)和石英砂無菌系統(tǒng)進行定殖突變體的

3、篩選，獲得了9株在番茄根尖表現出定殖能力缺陷的突變體，并且這9個突變體在溫室盆栽定殖試驗中同樣定殖缺陷。Southern雜交檢測發(fā)現9個突變體中有6個是單基因位點突變，其中有3個突變體的轉座插入位點相同。通過反向PCR等方法從9個突變體中獲得7個插入位點側翼序列，對側翼序所在基因進行PCR驗證，結果表明其中4個基因的片段長度增加了與轉座元件片段長度相同的1500bp，測序和序列比對后在基因的內部找到了轉座元件插入的位置。此外，采用同源重

4、組雙交換方法將這4個基因分別定點突變后，突變體的定殖水平同樣表現出定殖能力缺陷，再次證實了這4個基因參與了枯草芽孢桿菌OKB105在番茄根表的定殖過程。這4個基因分別為:lysC基因，參與半胱氨酸和甲硫氨酸的代謝，能夠感應賴氨酸水平，受饑餓響應系統(tǒng)調控;bltR基因，轉錄因子，調控一個廣義的外排轉運系統(tǒng);yjbQ基因，編碼細胞膜上的N/H+反向轉運系統(tǒng)，維持細胞內的pH和鈉離子的平衡;minJ基因，二分裂拓撲學因子，破壞后形成絲線狀的多

5、核細胞并失去群集運動(Swarming)能力。它們影響定殖的機制有待于進一步研究。
　　 2)本部分研究枯草芽孢桿菌OKB105的swarming對定殖的影響。鑒于OKB105的swarming調控基因swrA基因退化成了2個swrAA殘基，延遲了swarming的啟動。首先將解淀粉芽孢桿菌FZB42的swrA基因整合到了OKB105菌株的amyE基因中獲得了swarming能力正常的衍生菌株SWR01。以SWR01菌株為對象研

6、究swarming以及其它二個曾被報道影響定殖的因素鞭毛和surfactin，三者對定殖的影響。研究發(fā)現，swrA、表面活性素編碼基因srfAC和鞭毛編碼基因hag被突變后均能影響該菌株在半固體平板上的swarming能力，同時顯著地降低菌株在番茄根表的定殖水平，并且swarming能力與在根表的遷移能力成正相關關系。經分析表明，鞭毛、swarming和surfactin都對定殖水平產生重要影響，但是究其原因，鞭毛和surfactin均

7、是通過影響swarming間接地影響定殖的，swarming是重要的影響定殖的直接因素。
　　 3)本部分研究一個被推測可能與定殖相關的yczE基因的功能。該基因的功能未知，編碼一個假定的跨膜蛋白。構建了解淀粉芽孢桿菌FZB42、CO6和枯草芽孢桿菌OKB105等3個菌株的yczE基因突變體，并檢測了yczE基因對芽孢桿菌一些性狀的影響。發(fā)現了2個受yczE基因影響的性狀:(1)yczE基因有助于芽孢桿菌營養(yǎng)細胞忍耐致死高溫。在

8、SSM產孢培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～8 h（吸光度OD600=1.4～1.9）階段，突變體在高溫處理后(80℃，20 min)活細胞數量只有野生型的5％～10％。一般認為，芽孢桿菌耐受高溫是因為產生芽孢，但是芽孢染色沒有檢測到成熟的芽孢，表明該時期可能是產孢前期或者更早。通過qRT-PCR檢測產孢前期以及一些其他細胞分化途徑的相關基因，發(fā)現突變體的基因表達水平相當于親本菌株的0.44～2.31倍，表明yczE基因幾乎不影響產孢等細胞分化途徑，其作

9、用機理還有待于進一步研究。(2) FZB42菌株的yczE突變體swarming速度減慢，但OKB105和CO6并沒有受到影響。據報道影響swarming速度的主要因素是鞭毛數量和表面活性物質的含量。鞭毛染色試驗沒有檢測到y(tǒng)czE突變體的鞭毛數目變化;溶血試驗和質譜分析結果顯示，突變體的表面活性物質的產量下降但是主要的表面活性物質的種類并沒減少。所以，我們認為表面活性物質產量降低是突變體swarming速度下降的直接因素。另外，本研究還

10、檢測了yczE基因對抑菌物質的影響。平板抑菌試驗結果表明，3個菌株的yczE突變體對于水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae)和油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary)的抑制能力均沒有明顯改變，同時質譜檢測結果表明突變體產生的脂肽類化抗生素的種類也沒有減少，說明絕大部分抑菌物質的合成均幾乎不受yczE基因的影響。
　　 4)本論文還對3株枯草芽孢

11、桿菌168、OKB105和OKB105Harpin在番茄上定殖動態(tài)以及對促生作用和生防效果的影響進行了研究。168是枯草芽孢桿菌模式菌株，OKB105是168衍生菌株能夠產生大量的脂肽類抗生素surfactin，OKB105Harpin是本實驗室在OKB105的基礎上構建的工程菌能夠表達植物生防因子Harpin。為了便于檢測這3個菌株在番茄根部的定殖情況，用攜帶綠色熒光蛋白(Green FluorescentProtein，GFP)的穿

12、梭載體pAD43-25對這3株菌株進行標記。經檢測，該標記載體在宿主菌中能穩(wěn)定遺傳，并且對宿主菌的生長發(fā)育沒有明顯的影響。在番茄根表的定殖結果表明，在灌根處理后的35天中，3個菌株在番茄根部定殖數量波動一致，均是先呈拋物線趨勢然后維持在一個平穩(wěn)的水平，它們的定殖密度均在同一數量級(104～105CFU/cm)但也存在差異，OKB105定殖密度最高，OKB105Harpin次之，168最低;3個菌株在番茄根表定殖的位置和形態(tài)完全一致，在根