印度酸橘CrNCED1啟動(dòng)子克隆及脅迫響應(yīng)分析.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、植物在生長(zhǎng)過(guò)程要經(jīng)歷各種逆境,當(dāng)植物受到鹽害、低溫、干旱等環(huán)境脅迫時(shí),植物細(xì)胞自身會(huì)迅速積累ABA響應(yīng)逆境,因此ABA是一種非常重要的逆境激素。NCED是ABA合成中的限速酶。本實(shí)驗(yàn)室克隆的印度酸橘基因CrNCED1受脅迫誘導(dǎo),具有抗逆功能,但其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制并不清楚,因此分析CrNCED1基因啟動(dòng)子特有元件,研究其表達(dá)調(diào)控對(duì)闡明CrNCED1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及分離脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子有至關(guān)重要的意義。
   1.根據(jù)甜橙數(shù)據(jù)庫(kù),利用同源序列

2、法克隆出CrNCED1基因1989 bp啟動(dòng)子序列。PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示,此段序列區(qū)域除了含有TATA盒和CAAT盒等基本元件外,還含有ABRE、MYBCORE、BIHD10S、ERELEE4、GT1GMCAM4S等與逆境密切相關(guān)的元件。它們集中分布在ATG上游的1000 bp左右。
   2.設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了1058 bp的啟動(dòng)子片段,將其連接到酶切掉CaMV35S啟動(dòng)子的pCAMBIA1391雙元表達(dá)載體上,農(nóng)桿菌介導(dǎo)

3、法轉(zhuǎn)化煙草,通過(guò)潮霉素篩選,,獲得了煙草轉(zhuǎn)基因植株。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),單純的DNA提取,PCR鑒定并不能獲得具有GUS活性的陽(yáng)性植株,但是將DNA鑒定出來(lái)的植株進(jìn)一步提取RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA進(jìn)行鑒定,獲得的植株一定是陽(yáng)性株,通過(guò)此方法獲得轉(zhuǎn)基因株系#7和#8系。
   3.進(jìn)行組織特異性分析,選取轉(zhuǎn)基因株系(#7、#8)進(jìn)行GUS染色。結(jié)果表明,種子和果莢,沒(méi)有GUS基因表達(dá),在葉片和果蒂中有較高的GUS表達(dá)。利用震動(dòng)切片和微分

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