1、Cd2+作為主要的環(huán)境限制因子之一，顯著影響貝類的生長和珍珠的品質(zhì)。然而，環(huán)境Ca2+如何影響貝類珍珠質(zhì)沉積的分子機(jī)制目前仍不清楚。本研究以我國最主要的淡水育珠蚌——三角帆蚌（Hypriosis cumingii）為材料，以Ca2+濃度為關(guān)鍵調(diào)控因子，通過測定不同Ca2+濃度下珍珠質(zhì)沉積量、珍珠質(zhì)晶體形態(tài)、組織酶活性等指標(biāo)，篩選出適宜三角帆蚌珍珠質(zhì)沉積的水體Ca2+濃度，為養(yǎng)殖業(yè)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù);通過數(shù)字基因表達(dá)譜分析(RNA-Seq)，篩

2、選出參與珍珠質(zhì)形成的主要礦化相關(guān)基因，確定Ca2+濃度影響珍珠質(zhì)沉積的主要代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而闡明Ca2+影響三角帆蚌珍珠質(zhì)沉積的分子機(jī)理，也為貝類生物礦化機(jī)制提供新的研究思路。
　　1、采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)克隆了三角帆蚌鈣代謝關(guān)鍵的調(diào)控因子鈣調(diào)蛋白(CaM)及其類似蛋白（CaLP）基因的cDNA全長序列，序列長度分別為726 bp和1217bp。組織特異性表達(dá)分析表明CaM mRNA主要在鰓、外套膜中央膜

3、和腹足中表達(dá)，而CaLP mRNA主要在外套膜緣膜突起中表達(dá)。Ca2+遷移電泳結(jié)果表明，重組CaLP蛋白比重組CaM蛋白具有更高的Ca2+親合力。Ca2+刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CaM和CaLP在不同Ca2+濃度下(0.25-1.25 mM)具有不同的表達(dá)模式，CaM mRNA在Ca2+低濃度(0.25 mM)時表達(dá)量最高，而CaLP mRNA在1.0 mM Ca2+濃度時表達(dá)量最高。
　　2、采用RACE技術(shù)克隆了三角帆蚌中重要的礦化

4、相關(guān)基因α-碳酸苷酶（HcCA）cDNA的全長序列，長度為1911 bp，編碼550個氨基酸。時空表達(dá)分析表明，HcCA mRNA主要在幼蚌的外套膜中表達(dá)。空氣干露、低溫和低pH處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HcCA mRNA的表達(dá)受到上述環(huán)境因子的影響，提示其可能在體內(nèi)酸堿平衡中發(fā)揮了重要作用。
　　3、不同Ca2+濃度下三角帆蚌養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1齡三角帆蚌在Ca2+濃度在1.0 mM時生長最快，2齡未植片三角帆蚌在Ca2+濃度1.0-1

5、.75 mM時生長性狀和珍珠質(zhì)沉積上優(yōu)于其它Ca2+濃度，2齡植片三角帆蚌在Ca2+濃度1.0 mM時珍珠沉積量最大。珍珠質(zhì)小片拉曼光譜和掃描電鏡觀察結(jié)果表明，1.5 mM Ca2+濃度處理組珍珠質(zhì)小片中有機(jī)質(zhì)的含量高于其它處理組小片的含量。鰓和外套膜組織中堿性磷酸酶(AKP)、Ca-ATP酶、Mg-ATP酶活性測定結(jié)果表明，Ca2+濃度在1.0 mM-1.75 mM時有利于三角帆蚌Ca2+的吸收和蓄積。因此，1.0-1.75mM Ca

6、2+濃度為2齡三角帆蚌生長和珍珠質(zhì)沉積適宜的水體Ca2+濃度。
　　4、采用Illumina HiSeqTM2000平臺對外套膜邊緣膜組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組從頭測序（RNA-Seq），獲得約50M高質(zhì)量reads，組裝成61，119個平均長度為450 bp的Unigene作為參考基因組。Unigene在NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫中共有15，655個獲得注釋。其中6，322個被注釋到生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組

7、分GO類別的55個功能組，11，670個Unigene匹配到25類COG功能組，6，322個Unigene被富集到257條KEGG代謝途徑。分析發(fā)現(xiàn)三角帆蚌貝殼基質(zhì)蛋白Unigene37個，生物礦化相關(guān)基因Unigene55個，鈣代謝相關(guān)基因Unigene94個。
　　5、采用RNA-Seq技術(shù)對0.25 mM、1.5 mM和2.0 mM Ca2+濃度處理組2齡三角帆蚌外套膜邊緣膜組織進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。結(jié)果表明，在1.5 mM

8、 vs0.25mM比對組中共有1604個DEGs表達(dá)上調(diào)，1489個DEGs表達(dá)下調(diào);在1.5 mMvs2.0 mM比對組中共有762個DEGs表達(dá)上調(diào)，596個DEGs表達(dá)下調(diào);篩選出2個比對組中均差異表達(dá)的基質(zhì)蛋白DEGs4個（Papilin、Shematrin8、Nacreserine protease inhibitor1、Perlucin6），生物礦化相關(guān)DEGs13個(Chitin synthase、Carbonic anh

9、ydrase、C-type lectin等)，鈣代謝相關(guān)DEGs5個(Calmodulin-likeprotein、Sarcoplasmic calcium-binding protein、Troponin C等)。KEGG代謝途徑顯著性富集分析結(jié)果表明，1.5 mM vs0.25 mM比對組中有384個DEG被富集到維生素消化和吸收、蛋白消化和吸收、吞噬體、酪氨酸代謝等24個代謝途徑;1.5 mM vs2.0 mM比對組中有426個D