1、<p>　　廊 坊 師 范 學(xué) 院</p><p>　　本科生畢業(yè)論文（設(shè)計）</p><p>　　題 目：香菇中黃酮類化合物提取與分離</p><p>　　姓 名：趙江濤</p><p><b>　　指導(dǎo)教師：史振霞</b></p><p>　　系 別：生物科學(xué)<

2、;/p><p>　　專 業(yè)：生物科學(xué)</p><p>　　年 級：2008級本科1班</p><p>　　完成日期 2012年5月30日</p><p><b>　　論文題目：</b></p><p>　　香菇中黃酮類化合物提取方法研究 </p><p>　　摘

3、　要 黃酮類化合物是一類具有廣泛開發(fā)應(yīng)用前景的天然藥物,目前對香菇中黃酮類化合物研究較少，本文主要探討對香菇中黃酮類化合物提取方法，黃酮類化合物在真菌組織中，一般多以苷的形式存在，本文介紹了各種提取方法的原理、特點及其在黃酮化合物中的應(yīng)用,全面了解香菇的特性以及黃酮類化合物在香菇中的存在形式，設(shè)計驗證最優(yōu)提取方案。對藥用菌中黃酮類化合物提取方法的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。</p><p>　　關(guān)鍵詞 香菇 黃酮類化合物

4、 提取</p><p>　　Thesis Topic:</p><p>　　Extraction and separation of flavonoids in the fermentation of </p><p>　　Pleurotus ferulae Lenzi</p><p>　　Thesis Topic:

5、 </p><p>　　Extraction and separation of the flavonoids in the mushrooms </p><p>　　Abstract： Flavonoids are a class of natural medicine has broad prospects for the development and

6、 application of Mushroom fewer flavonoids, This paper discusses the extraction ofmushrooms in flavonoids and flavonoid compounds in the fungal tissue, and more generally to the glycosideexists in the form, this paper int

7、roduces the principle of thevarious extraction methods of flavonoids, a comprehensive understanding of themushroom features, and flavonoids in the mushrooms in a form, design validatio</p><p>　　Key word： Mu

8、shrooms flavonoids extraction</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　1 前言................................................1</p><p>　　2 材料與方法......................................

9、....2</p><p>　　2.1供試菌種.................................................. .2</p><p>　　2.2培養(yǎng)基配方..................................................2</p><p>　　2.3 主要儀器...................

10、........................... ....2</p><p>　　2.4菌種活化........................................ ...... ....2</p><p>　　2.5平板擴大培養(yǎng)........................................... ....2</p><p>　　

11、2.6搖瓶培養(yǎng).............................................. .....2</p><p>　　2.7發(fā)酵上清液的制備................................ ...... ....2</p><p>　　2.8試驗方法............................................ ......

12、.3</p><p>　　3 結(jié)果分析............................................4</p><p>　　4 討論................................................6</p><p>　　5 結(jié)論.........................................

13、.......7</p><p>　　參考文獻(xiàn)..............................................8</p><p>　　致謝..................................................9</p><p><b>　　1 前言</b></p><

14、p>　　香菇是人們重要的食用、藥用菌和調(diào)味品。香菇的鮮味成分是一類水溶性物質(zhì)，其主要成分是5′-鳥苷酸、5′-AMP、5′-UMP等核酸構(gòu)成成分，均含0.1%左右。其香味成分主要是香菇酸分解生成的香菇精。</p><p>　　香菇中黃酮類化合物對超氧自由基、羥基自由基的清除作用,研究表明:香菇中總黃酮提取率為0.738%,香菇中黃酮類化合物對清除自由基有一定的作用。</p><p>

15、　　黃酮類化合物是一類廣泛分布于植物體內(nèi)的多酚類物質(zhì)，具有特殊的保健和藥用功能。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對黃酮類物質(zhì)的研究越來越廣泛而深入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黃酮不少新應(yīng)用，如　1 在食品領(lǐng)域的市場前、黃酮類飲料、黃酮類保健食品、抗氧化劑、在藥物 領(lǐng)域中的開發(fā)、作為飼料抗氧化劑的發(fā)展前景</p><p>　　黃酮類化合物在真菌組織中，一般多以苷的形式存在，而在木部堅硬組織中，則多以游離苷元形式存在。黃酮苷類以及極性稍大

16、的苷元（如羥基黃酮、雙黃酮、橙酮、查耳酮等），一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些極性較大的混合溶劑進(jìn)行提取。其中用得最多的是甲醇－水（1∶1）或甲醇。一些多糖苷類則可以用沸水提取。在提取花青素類化合物時，可加入少量酸（如0.1％鹽酸）。但提取一般黃酮苷類成分時，則應(yīng)當(dāng)慎用，以免發(fā)生水解反應(yīng)。為了避免在提取過程中黃酮苷類發(fā)生水解，常按一般提取苷的方法事先破壞酶的活性。大多數(shù)黃酮苷元宜用極性較小的溶劑，如氯仿、乙醚、醋酸乙酯等提取，對多

17、甲氧基黃酮的游離苷元，可用苯進(jìn)行提取。比較容易操作的方法是酸堿法。</p><p>　　本實驗以香菇作為提取分離原料用不同的提取方法提取出其中的黃酮類物質(zhì)，然后用分光光度計測定個方法的吸光度計算提取比，得到最合理的提取方法，達(dá)到香菇中黃酮類物質(zhì)的提取分離，研究香菇的藥用價值和營養(yǎng)價值。</p><p><b>　　2材料與方法</b></p><p

18、><b>　　2.1實驗材料</b></p><p>　　香菇（超市銷售的干香菇） 蘆丁（制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）</p><p><b>　　2.2實驗試劑</b></p><p>　　無水乙醇，95%乙醇，90%乙醇，85%乙醇，80%乙醇，75%乙醇，70%乙醇 ，纖 維素酶，10%硝酸鋁溶液，5%的亞硝酸鈉溶液，4%的

19、氫氧化鈉溶液 </p><p><b>　　2.3主要儀器</b></p><p><b>　　索氏提取器，</b></p><p>　　HQ——-型電子控溫電熱器，</p><p>　　TDL-40B高速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），</p><p>　　S22PC

20、-型分光光度計（上海棱光有限公司） </p><p><b>　　臺式磨粉機</b></p><p><b>　　2.4 材料處理</b></p><p>　　用電子天平準(zhǔn)確稱取2g香菇粉末16份，分別放入16個100ml三角瓶中，加蒸餾水50ml，加入10mg纖維素酶，控制溫度在40℃-~45℃， 用鹽酸HCl溶液調(diào)節(jié)p

21、H值在6.5-~7.0之間酶解時間為60min。</p><p>　　2.5實驗方案及步驟</p><p>　　2.5.1 優(yōu)化實驗</p><p>　　運用正交試驗法，以L16(45)因素水平表，設(shè)計方案。取乙醇濃度、提取時間、提取溫度為香菇中黃酮類化合物提取工藝優(yōu)化試驗的 3個因素，各試驗因素的水平分別為：乙醇（丙酮）濃度（A）：75％、80％、85％、90％；

22、提取溫度（B）：4℃、70℃、80℃、90℃；提取時間（C）：1h、1.5h、2h、2.5h，從均勻正交設(shè)計表中選用L16（45）表，見表1。</p><p>　　表1 正交因素-水平設(shè)計表</p><p>　　Tab.1　Factor- level table of orthogonal test</p><p>　　2.5.2 黃酮的提取工藝</p>

23、;<p>　　將經(jīng)過纖維素酶處理過的香菇干粉液轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，用對應(yīng)濃度乙醇定容至刻度，然后轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中，在不同溫度下用索氏提取器回流提取不同的時間，抽濾，濾液即為黃酮提取液，轉(zhuǎn)入100ml容量瓶，用相應(yīng)濃度乙醇定容至刻度。</p><p>　　2.5.3 指標(biāo)測定</p><p>　　2.5.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定</p><p>　　2.

24、5.3.1.1．標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 </p><p>　　取120℃真空干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品約50mg精密稱定，置于50mL容量瓶，</p><p>　　水浴上微熱，使溶解，放冷后用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。</p><p>　　2.5.3.1.2．繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 </p><p>　　精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00，1.00，2.00，3.00，

25、4.00及5.00mL，分別置于50mL容量瓶中，各加60% 乙醇使成5.0mL，各精密加入亞硝酸鈉溶液（1:20）0.5搖勻，放置6分鐘后，加硝酸鋁溶（1:10)1.5mL， 搖勻，放置6分鐘，加1 mol?L-1氫氧化鈉試液4mL，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置15分鐘。在510nm 波長下測定各溶液的吸光濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　表2 分光光度法測定蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線&l

26、t;/p><p>　　Table 2 spectrophotometric method for the determination of standard curve of rutin</p><p>　　2.5.3.2 黃酮含量的測定</p><p>　　精密吸取濾液5.00mL，分別置于50mL容量瓶中，各精密加人5%的亞硝酸鈉溶液0.80mL,混勻，放置10m

27、in;加入10%硝酸鋁溶液0.80mL , 混勻，放置10min,再加入4%的氫氧化鈉溶液10.00mL, 混勻，放置10min，加入85%的乙醇溶液至刻度，搖勻，10min后于波長500nm處測定吸光度。</p><p><b>　　3結(jié)果分析</b></p><p>　　3.1蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　分光光度法的黃酮回歸方程為A

28、=6.79006x-0.0011，R=0.99963。</p><p>　　圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖</p><p>　　3.2 乙醇為提取劑提取黃酮產(chǎn)量結(jié)果及分析</p><p>　　以乙醇為提取試劑對香菇干粉在不同濃度（75％、80％、85％、90％），不同溫度（4℃、70℃、80℃、90℃），不同時間（1h、1.5h、2h、2.5h）條件下提取多糖，結(jié)果見表3

29、，對測定結(jié)果，進(jìn)行L16(45)分析，結(jié)果及分析見表3，表4。</p><p>　　表3 香菇中黃酮化合物提取正交試驗結(jié)果</p><p>　　Tab.6 Results of Flavonoid compounds in the mushroom extract orthogonal experiment </p><p>　　表4乙醇萃取香菇中黃酮含量正交試驗結(jié)

30、果</p><p>　　Table 3 the orthogonal experimental results of Ethanol extract of the orthogonal experiment results of the flavonoid content in mushrooms </p><p>　　從表3和表4中可以看出，在以乙醇萃取黃酮時，因素B差異達(dá)顯著水平，而

31、因素A、C未達(dá)到顯著水平。說明溫度是影響提取效果最關(guān)鍵的因子，其次是濃度，最后是時間。對因素B應(yīng)選擇其最優(yōu)水平B3,而因素A、C選擇任一水平都可。綜合考慮生產(chǎn)得率,最佳水平應(yīng)為A2B3C4。即最佳提取方案是溫度80℃，濃度85％，時間2.5h。</p><p><b>　　4討論</b></p><p>　　4.1 提取溫度黃酮提取量的影響：</p>&

32、lt;p>　　在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度的增加，黃酮的提取量持續(xù)增加，但如果溫度過高，乙醇沸騰劇烈，蒸發(fā)較快回流循環(huán)就比較頻繁，那么乙醇就與香菇粉末接觸的時間比較短，即相互作用的時間比較短，達(dá)不到充分萃取的最佳狀態(tài)。所以提取溫度應(yīng)該控制在一個比較合理的狀態(tài)，本實驗得出最適提取為80℃。</p><p>　　4.2 提取劑濃度對黃酮提取量的影響：</p><p>　　乙醇濃度對黃酮提取呈

33、草帽形，以85%濃度的為草帽頂端，濃度高于或低于85%都不利于黃酮的提取。同時乙醇有沉淀雜質(zhì)多糖和其他有機物質(zhì)的作用，所以提取劑最適提取濃度是未知的，本實驗中選了四種不同的乙醇濃度進(jìn)行試驗。針對香菇中的黃酮提取，當(dāng)乙醇的濃度為85%時效果最佳，乙醇濃度升高，會影響黃酮的提取效果。</p><p>　　4.3 提取時間對黃酮提取量的影響：</p><p>　　在一定的時間范圍內(nèi)，黃酮的提取率

34、會隨著時間的延長而增加，但是時間達(dá)到一定程度，黃酮的提取率則不會在增加，因為香菇中的黃酮已基本提取完畢，如果此時繼續(xù)操作，成本會逐漸增加，所以為了節(jié)約成本和實驗的方便，提取黃酮要采取一個合適的時間。</p><p>　　4.4 影響黃酮提取率的因素的主次順序：</p><p>　　由表7，表10的試驗因素極差分析表明:影響黃酮提取率的因素的主次順序分別為：B（溫度）＞A（濃度）＞C（時間）

35、；即溫度對香菇黃酮的提取的影響最大，濃度和時間次之。</p><p><b>　　5結(jié)論</b></p><p>　　本研究通過對香菇黃酮進(jìn)行提取，冷凝回流提取和抽濾，以不同濃度乙醇，在不同提取時間，不同的提取濃度對黃酮成分進(jìn)行提取，并進(jìn)行優(yōu)化，為香菇黃酮提取和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。實驗結(jié)果表明溫度是影響黃酮提取得率的最主要因素，提取時間、乙醇濃度也是影響黃酮提取率的

36、主要因素之一。分析結(jié)果表明：乙醇最佳提取工藝條件組合為A3B1C3，即提取溫度為80℃,，乙醇濃度85％，提取時間為2h，黃酮提取量最高。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1]宋秋華,張磊,梁飛,等. 黃酮類化合物提取和純化工藝研究進(jìn)展. 山西化工, 2007, 27 (4) : :24～27.</p><p&g

37、t;　　[2]張勝幫,趙玲玲. 黃酮類化合物的提取純化研究進(jìn)展. 溫州大學(xué)學(xué)報·自然科學(xué)版, 2007, 5: 25～28</p><p>　　[3]金春雪,上官進(jìn),劉政,等. 黃酮苷類化合物的提取與初步分析[ J J]. 信陽師范學(xué)院學(xué)報, 1998 (2) :: 186～187.</p><p>　　[4]代容春,何文錦,劉萍,等. 扁蓄總黃酮提取方法的比較[ J ]. 植物

38、資源與環(huán)境學(xué)報, 2003, 12 (3) : 53～54.</p><p>　　[5]丁利君,吳振輝,蔡創(chuàng)海,黃曉珊. 菊花中黃酮類物質(zhì)提取方法的研究[ J ]. 食品工業(yè)科技, 2002 (2) : 20～22.</p><p>　　[10] 江艷華,江曉路.白靈菇液體培養(yǎng)條件的研究及栽培試驗[J].食用菌學(xué)報,2005,12(1):37-41.</p><p>

39、;　　[11] 張桂春,辛?xí)粤?梁建光,等.金頂側(cè)耳胞外多糖測定方法的選擇及提取工藝的優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2005,21(3):230-233.</p><p>　　[16]許鋼,張虹,胡劍. 竹葉黃酮的提取方法[ J ]. 分析化學(xué), 2000, 28 (7) : 857～859.</p><p>　　[17]王蘭珍,馬希漢,王妹清,等. 元寶楓葉總黃酮提取方法研究[ J ]. 西

40、北林學(xué)院學(xué)報, 1997, 12 (4) : 64～67.</p><p>　　[18]劉峙嶸,俞自由,方裕勛,等. 微波萃取銀杏葉黃酮類化合物[ J ]. 東華理工學(xué)院學(xué)報, 2005, 28 (2) : 151～- 154.</p><p>　　[19]吳傳茂,董青,吳周和,等. 超聲波振蕩法提取大豆和豆豉中大豆異黃酮甙元及用HPLC檢測其含量的研究[ J ]. 飼料工業(yè), 20

41、06, 27 (16) ∶47 - 49.</p><p>　　[20]王正云. 超臨界CO2 萃取蘆筍中總黃酮的工藝研究[ J ]. 食品研究與開發(fā), 2007 (10) : 42～45.</p><p>　　[21]黃劍波,孫哲浩,董華強. 酶解輔助提取甜茶黃酮類化合物的研究[ J ]. 食品研究與開發(fā), 2008, (2) : 36～40.</p><p>　

42、　[22]陳曉娟,周春山. 酶法及半仿生法提取杜仲葉中綠原酸和黃酮[ J ]. 精細(xì)化工, 2006, 23 (3) : 257～260.</p><p>　　[23]張春秀,胡小鈴,盧錦花,等. 雙水相萃取法富集分離銀杏葉浸取液的探討[ J ]. 化學(xué)研究與應(yīng)用, 2001,13 (6) : 686～688.</p><p>　　[24]于濤,錢和. 膜分離技術(shù)在提取銀杏葉黃酮類化合物中

43、的應(yīng)用[ J ]. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報, 2004, 23 (6) : 55～58.</p><p>　　[25]Kari Hartonen, Jevgeni Parshintsev, Kati Sandberg etal. Isolation off lavonoids from aspenknotwood by pressurized hotwater extraction and comparison wit

44、hother extraction techniques. Talanta, 2007, (74) : 32～38.</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　論文即將完成之際才發(fā)現(xiàn)大學(xué)四年的時光己即將結(jié)束，暮然回首，四年間的經(jīng)歷，其中的酸甜苦辣，無數(shù)的學(xué)習(xí)時光中的緊張和忙碌都成為記憶中不可磨滅的一頁。在論文寫作過程中，我得到了來自老師、同學(xué)的多方

45、面指導(dǎo)、幫助和關(guān)心。謹(jǐn)在此表達(dá)我深深的謝意。</p><p>　　首先應(yīng)該感謝的是我的指導(dǎo)老師史振霞老師，本文是在她的悉心指導(dǎo)下完成的，從論文選題、理論分析到論文撰寫，無不傾注了史老師的心血和汗水。她科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，踏踏實實的工作作風(fēng)，平易近人、無私奉獻(xiàn)的人格魅力深深感染了我，激勵著我，使我終生受益。在此，謹(jǐn)向史老師致以衷心的感謝和深深的敬意!</p><p>　　人生的道路有許多的坎

46、坷，不是一條通往光明之路，有痛苦，有傷心，有無助，也有面對一切所不能忍受的，這就是生活。但是生活中確實有許多美好的東西，有些時候你不會看到它的本身的色彩，如果你用這一種方式感受不到的話，不妨換一種方式去感受，也許它正是你所需要的那種生活方式。千萬不要放棄生活，你放棄了它，生活也就放棄了你，人生貴在的是感受，會感受才會有幸福，在生活中如果你感受的多了，那你才會感受到生活中的美好，你才會知道你在前世所選擇的是今生的最正確的人生路。</