1、豬TTV(Torque teno virus)又名豬輸血傳播病毒（transfusion transmitted virus）。屬于細(xì)環(huán)病毒科(Anelloviridae)，壬型細(xì)環(huán)病毒屬(Iotatorquevirus)。從1999年首次證實(shí)TTV存在于豬群中，許多學(xué)者對(duì)豬TTV進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)豬TTV早在1985年就存在于西班牙豬場(chǎng)中，并且已在世界范圍內(nèi)流行。雖然尚未有豬TTV直接致病的報(bào)道，但其廣泛流行性以及與其他疾病之間

2、的關(guān)系已經(jīng)使之不容忽視。鑒于目前國(guó)內(nèi)對(duì)豬TTV的檢測(cè)方法仍以PCR為主，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)國(guó)內(nèi)流行的TTV2的ORF1的部分基因進(jìn)行了表達(dá)，并以獲得的純化蛋白作為抗原建立了間接ELISA檢測(cè)方法，為該病毒提供了血清學(xué)檢測(cè)手段，同時(shí)為建立標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)試劑盒以及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　 1豬TTV2 ORF1的部分基因在大腸桿菌BL21中的克隆與表達(dá)本研究根據(jù)Genbank中已發(fā)表的豬TTV2的ORF1基因序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物。以提取的TT

3、V2DNA為模板，通過(guò)PCR的方法分別擴(kuò)增出1206bp和855bp兩個(gè)片段，將這兩個(gè)擴(kuò)增片段分別插入克隆載體pMD18-T，測(cè)序驗(yàn)證正確。然后分別將兩個(gè)克隆質(zhì)粒以及表達(dá)載體pcold同時(shí)用XhoⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，將酶切后的兩段基因分別與酶切后的表達(dá)載體進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot印跡分析，證實(shí)兩種蛋白在大腸桿菌中均得到了高效表達(dá)，分子量分別約為52

4、KD和39KD。
　　 2重組蛋白的純化以及多克隆抗體的制備表達(dá)的兩種蛋白均以包涵體的形式存在，因此在純化過(guò)程中需進(jìn)行超聲破碎，然后用鎳柱進(jìn)行純化。將純化的兩種蛋白分別免疫新西蘭大白兔。首免時(shí)要將抗原與弗氏完全佐劑1∶1混勻，并于首免之前耳緣動(dòng)脈采血作為陰性對(duì)照。之后每隔兩周免疫一次，并將抗原與弗氏不完全佐劑1∶1混勻，共免疫4次。末次免疫7天后對(duì)兔進(jìn)行心臟采血，經(jīng)Western blot檢測(cè)在相應(yīng)位置處有清晰的條帶，間接ELI

5、SA檢測(cè)多抗效價(jià)達(dá)1∶12800。
　　 3間接ELISA檢測(cè)方法的建立將純化得到的pcold-g1蛋白作為抗原包被ELISA板，建立了豬TTV2的間接ELISA檢測(cè)方法，并確定了間接ELISA檢測(cè)的最佳條件:抗原最佳包被濃度為1.65μg/ml，血清最佳稀釋度為1∶160，最佳包被液和封閉液分別為碳酸鹽緩沖液和2％脫脂奶粉，最佳包被條件為4℃包被過(guò)夜，最佳封閉時(shí)間為37℃2h，血清作用時(shí)間1h，二抗?jié)舛?∶4000，二抗37℃