1、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我國(guó)主要的淡水育珠蚌,在我國(guó)五大淡水湖泊中資源豐富。但由于過(guò)度開(kāi)發(fā)、環(huán)境污染等原因,三角帆蚌資源顯著減少,保護(hù)天然種質(zhì)資源是開(kāi)展三角帆蚌育種的基礎(chǔ)。本研究采用磁珠富集法開(kāi)發(fā)了三角帆蚌20對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星,選用多態(tài)性高的10對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)價(jià)了鄱陽(yáng)湖(PY)和太湖(TH)中不同年齡群體、不同性別群體的遺傳結(jié)構(gòu),分析了這些野生群體三角帆蚌的遺傳變化規(guī)律,并對(duì)新鮮組織與無(wú)水乙醇固定不同時(shí)間組織間D

2、NA提取效果及幼蚌活體取樣生長(zhǎng)效果進(jìn)行了比較,以期為三角帆蚌種質(zhì)資源保護(hù)、資源評(píng)估及合理利用提供理論依據(jù),主要內(nèi)容如下。
　　1.三角帆蚌微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選及多態(tài)性分析
　　采用磁珠富集法,以生物素標(biāo)記的(CA)10寡核苷酸為探針,構(gòu)建了三角帆蚌基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)。根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物,隨機(jī)挑選擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的32對(duì)引物,引物熒光標(biāo)記后對(duì)洞庭湖群體的24個(gè)三角帆蚌個(gè)體分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共篩選出20對(duì)多態(tài)性較

3、好的引物。結(jié)果表明,20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)為5-20,有效等位基因數(shù)2.3213-13.2603。觀察雜合度和期望雜合度分別為0.3182-1.0000和0.5825-0.9461;PIC值0.5472-0.9199;其中14個(gè)位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。本研究篩選的20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記可作為三角帆蚌遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)等研究的理想分子標(biāo)記。
　　2.三角帆蚌不同年齡間遺傳多樣性分析
　　

4、采集了鄱陽(yáng)湖3~8齡297個(gè)和太湖7~15齡217個(gè)野生三角帆蚌,用10對(duì)具有高度多態(tài)性微衛(wèi)星引物,分別對(duì)上述不同年齡群體遺傳多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果表明:不同年齡群體間平均期望雜合度和平均Nei’s基因多樣性變化不大,說(shuō)明鄱陽(yáng)湖和太湖不同年齡群體間遺傳多樣性差異不明顯。比較平均等位基因數(shù)、平均期望雜合度和平均多態(tài)信息含量,發(fā)現(xiàn)鄱陽(yáng)湖7齡群體及8齡群體平均等位基因數(shù)和平均多態(tài)信息含量低于3齡至6齡群體,太湖9齡群體低于10齡群體、13齡群體

5、低于12齡群體和15齡群體,而其平均期望雜合度卻相對(duì)較大。不同年齡群體內(nèi)個(gè)體基因雜合度結(jié)果顯示鄱陽(yáng)湖7齡群體及8齡群體、太湖9齡群體及13齡群體個(gè)體基因雜合度大的比例相對(duì)較高。根據(jù)重大環(huán)境變化情況劃分了不同年齡段,遺傳參數(shù)結(jié)果顯示,鄱陽(yáng)湖3~5齡群體(PY1)遺傳多樣性低于鄱陽(yáng)湖6~8齡群體(PY2);太湖7~9齡群體(TH1)遺傳多樣性最高,其次為13~15齡群體(TH3),10~12齡群體(TH2)遺傳多樣性最小。10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)等

6、位基因差異顯示,鄱陽(yáng)湖不同年齡群體中除位點(diǎn)HcuCA0007、HcuCA0104外,其余8個(gè)位點(diǎn)在6齡(PY6Y)以后的群體中均出現(xiàn)等位基因丟失,太湖不同年齡群體中除位點(diǎn)HcuCA0100外,其余9個(gè)位點(diǎn)自9齡(TH9Y)開(kāi)始均檢測(cè)到新的等位基因。
　　3.三角帆蚌不同性別間遺傳多樣性分析
　　采集了鄱陽(yáng)湖雌蚌131個(gè),雄蚌166個(gè),太湖雌蚌118個(gè),雄蚌99個(gè),用10對(duì)具有高度多態(tài)性微衛(wèi)星引物,分別對(duì)上述鄱陽(yáng)湖和太湖野生三

7、角帆蚌雌雄群體遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明:鄱陽(yáng)湖雌雄群體的平均等位基因數(shù)分別為16.6和17.8,平均期望雜合度分別為0.811和0.813,平均Nei’s基因多樣性分別為0.8079和0.8106;太湖雌雄群體的平均等位基因數(shù)分別為14.2和17.6,雌雄群體的平均期望雜合度分別為0.7633和0.7747,平均Nei’s基因多樣性分別為0.7601和0.7708。鄱陽(yáng)湖和太湖雄性群體的平均期望雜合度和平均Nei’s基因多樣性都略高

8、于雌性群體,結(jié)果表明雄性群體遺傳多態(tài)性略高于雌性群體。
　　4.三角帆蚌新鮮組織與無(wú)水乙醇固定不同時(shí)間組織間DNA提取效果比較
　　利用酚-氯仿法分別提取三角帆蚌下列組織中的DNA:鰓、斧足、外套膜、閉殼肌4種新鮮組織,無(wú)水乙醇固定7天的上述組織,常溫保存1年、3年、4年和5年固定的外套膜組織。對(duì)這些組織的DNA提取質(zhì)量和PCR擴(kuò)增效果進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明,斧足、外套膜和閉殼肌新鮮和固定7天的組織,提取的DNA濃度較高、降

9、解不明顯、PCR擴(kuò)增效果較好,是提取三角帆蚌基因組DNA的好材料;但鰓新鮮和固定7天的組織,在提取DNA過(guò)程中易于降解,不適于作為三角帆蚌基因組DNA提取的樣本材料。經(jīng)無(wú)水乙醇固定7天組織均較新鮮組織提取的DNA,濃度高,降解少,SSR-PCR效果未見(jiàn)明顯差異,說(shuō)明無(wú)水乙醇處理新鮮組織可提高DNA提取效果。與無(wú)水乙醇固定7天后提取的三角帆蚌基因組DNA相比較,保存1年以上的樣品所提取DNA均有不同程度的降解,不適于提取高質(zhì)量DNA。保存

10、1年和3年外套膜組織提取的DNA降解水平對(duì)PCR擴(kuò)增效果影響不顯著,保存4年、5年的外套膜組織DNA降解水平對(duì)PCR擴(kuò)增效果影響顯著,需提高PCR模板用量。
　　5.三角帆蚌幼蚌活體取樣生長(zhǎng)效果比較
　　比較分析幼蚌剝離微量外套膜組織用于DNA提取后的生長(zhǎng)效果,結(jié)果顯示，DNA大分子條帶清晰明亮,DNA的濃度在42~130ng/μl,DNA含量在3360ng以上,OD260/OD280值在1.8以上,都能達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài),且