1、目的：Ca2+在細胞信號轉導中起著重要的作用，TRPV6是高度的Ca2+選擇性通道，是Ca2+向細胞內轉運的限速步驟。但是，TRPV6在雞體內的調節(jié)機制尚不清楚，本文旨在研究沉默TRPV6對鈣轉運基因的影響，進而闡明TRPV6在雞體內的調節(jié)機制。
　　方法：根據已知Genebank TRPV6 mRNA序列和siRNA的設計原則，利用美國Ambion公司的在線設計軟件，進行全基因掃描和分析。篩選3個可能的RNA干擾靶位點，設計3個

2、siRNA序列（與雞的其他基因無同源性）和一個陰性對照序列（該序列與任何雞類基因均無同源性）。按照選定的干擾靶位點設計相應的shRNA DNA表達模板，將shRNA與pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體連接，通過轉化、篩選、鑒定，選擇陽性克隆。為探明設計的3個TRPV6 RNA干擾質粒對成骨細胞TRPV6基因表達的抑制效果，提取高純度無內毒素TRPV6 RNA干擾質粒，并將其轉染到雞成骨細胞，同時采用Real-time PCR

3、和Western-blot的方法檢測TRPV6定量表達變化，篩選出能有效抑制TRPV6表達的質粒。并將該質粒轉染到雞成骨細胞，同樣地采用Real-time PCR和Western-blot的方法檢測鈣轉運基因、OPG和RANKL的定量表達變化。
　　結果：酶切和測序結果顯示，成功構建了雞TRPV6 RNA干擾質粒。在探明TRPV6 RNA干擾質粒對成骨細胞TRPV6基因表達的抑制效果的試驗中，Real-timePCR結果表明，與對

4、照組比較，在轉染48h后質粒pSIREN-TRPV6-3可使TRPV6的表達水平降低45.7％(P＜0.01)，質粒pSIREN-TRPV6-2可使TRPV6的表達水平降低27.8％(P＜0.05)，而pSIREN-TRPV6-1并未明顯改變TRPV6的表達(P＞0.05);Western-blot結果顯示，pSIREN-TRPV6-3可明顯抑制TRPV6的表達水平(P＜0.01)。將重組質粒pSIREN-TRPV6-3轉染到雞成骨細胞

5、，Real-time PCR結果顯示，calbindin-D28K的表達水平降低了27.9％(P＜0.01)，而PMCA1b、NCX1、OPG和RANKL的表達未發(fā)生改變。Western-blot結果表明:calbindin-D28K的表達顯著降低(P＜0.01)，RANKL的表達未明顯改變。
　　結論：成功構建了雞TRPV6 RNA干擾質粒;在成骨細胞鈣轉運過程中，TRPV6只調節(jié)calbindin-D28K的表達，而對NCX1