1、雙組分調(diào)控系統(tǒng)(Two-component Regulatory System)在致病菌的生長及毒力調(diào)控中起重要作用。本研究克隆了溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901株組氨酸激酶KdpD和反應(yīng)調(diào)控因子KdpE的全長基因，并對其進行生物信息學分析。序列分析結(jié)果顯示，kdpD（GenBank登錄號:KJ544668）全長1374bp，共編碼457個氨基酸;kdpE（GenBank登錄號:KJ476728）全長73

2、2bp，編碼243個氨基酸。構(gòu)建KdpD和KdpE的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示溶藻弧菌KdpD和KdpE與坎氏弧菌（V.campbellii）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）相應(yīng)蛋白有較近親緣關(guān)系。利用SWISS-MODEL軟件，對KdpD/KdpE中兩個相對保守的功能域HATPase_c和REC進行同源建模。
　　本研究采用Overlap PCR和同源重組技術(shù)，結(jié)合正負向篩選，構(gòu)建三株無標記基因框內(nèi)敲除突變株:△k

3、dpDE、△kdpD和△kdpE，比較突變株和野生株HY9901在生長速率、胞外蛋白酶活性以及毒力等方面的差異。結(jié)果顯示雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpDE對溶藻弧菌的生長曲線和胞外蛋白酶活性的影響不明顯，但是突變株的泳動能力和生物被膜形成能力出現(xiàn)下降。斑馬魚致病性實驗結(jié)果顯示，突變株△kdpDE的毒力下降了78.5倍，突變株△kdpD的毒力下降8.84倍，△kdpE的毒力下降19.6倍，這證實減毒株構(gòu)建成功。
　　本研究分析了突變株在水體中

4、的存活情況，菌體濃度在106CFU/mL條件下，14d后水體基本檢測不到突變株;最后考察了其在魚體內(nèi)的存活情況，注射免疫7d后，魚體內(nèi)不能檢測到該菌，表明該疫苗候選株是比較安全的。
　　以突變株△kdpDE，△kdpD和△kdpE為抗原，分別用注射和浸泡的方式免疫斑馬魚，免疫后第28天用溶藻弧菌和哈維氏弧菌攻毒，評估該突變株及不同免疫方式對斑馬魚的保護效果。實驗結(jié)果表明，免疫后的斑馬魚能夠抵抗溶藻弧菌的感染，其中注射組的免疫保護率