1、RNA沉默是生物(特別是真核生物)抵御外來核酸(病毒、轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)基因甚至人工注射的雙鏈RNA)入侵的一種防御機(jī)制，它廣泛存在于各種生物中。本研究主要內(nèi)容是分別在植物表達(dá)載體pRIR202反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的上游、中間間隔區(qū)(Loop環(huán))、下游插入GFP基因5'端的521 bp片段，通過瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)比較反向重復(fù)結(jié)構(gòu)不同位置側(cè)翼序列誘導(dǎo)基因沉默的差異，從而為培育多抗病毒轉(zhuǎn)基因植物，長時(shí)間高水平維持RNA介導(dǎo)的抗病性提供理論依據(jù)。 具體結(jié)果

2、如下： 1.克隆GFP 5'端的521 bp片段，分別插入植物表達(dá)載體pRIR202反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的上游、中間間隔區(qū)(Loop環(huán))、下游，成功構(gòu)建了植物雙元表達(dá)載體pRIR202UP、pRIR202MID和pRIR202DWN，并用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌C58C1中。 2.用農(nóng)桿菌共浸潤(滲入)的方法，將帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射入帶有GFP基因的單拷貝純合體轉(zhuǎn)基因煙草Nicotiana benthamiana line16C，以注射p

3、RIR202為空白對照。在長波(365 nm)紫外燈照射下，4天后在注射pRIR202UP、pRIR202MID和pRIR202DWN的部位都出現(xiàn)了紅色暈圈，并且隨時(shí)間變化紅色部位逐步蔓延和加強(qiáng)，而且pRIR202MID和pRIR202DWN的沉默效果強(qiáng)于pRIR202UP。 3.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，從分子水平檢測基因沉默的強(qiáng)度，9天后檢測GFP mRNA的相對累積量。注射pRIR202、pRIR202UP、pRIR20

4、2MID、pRIR202DWN的植株中的GFP mRNA積累量分別為1.0000、0.6598、0.4175和0.3209。23天后檢測GFP mRNA的相對累積量，依次分別為1.0000、0.2169、0.1996和0.1654。通過分析比較可以得出基因沉默的強(qiáng)弱依次為pRIR202DWN、pRIR202MID和pRIR202UP。 4.利用Western blot從蛋白水平分析GFP的含量，以注射pRIR202的野生型煙草(

5、N.benthamiana)為陰性對照，注射pRIR202的轉(zhuǎn)基因煙草(N.benthamiana line 16C)為陽性對照，野生型煙草的煙草中檢測不到GFP蛋白，而注射pRIR202、pRIR202UP、pRIR202MID和pRIR202DWN的16C植株中都檢測到TGFP蛋白，而且注射pRIR202的16C中GFP的蛋白含量明顯多于注射pRIR202UP、pRIR202MID和pRIR202DWN的16C煙草，注射pRIR2