1、水稻是重要的糧食作物，也是禾谷類作物功能基因組研究的模式植物。突變體是研究基因功能最直接、最有效的途徑之一，因此構建水稻大型突變體庫是在全基因組水平上大規(guī)模、全面、系統(tǒng)的研究基因功能的重要技術平臺。農(nóng)桿菌介導的T-DNA轉(zhuǎn)化因其在水稻基因組中相對隨機的分布規(guī)律，高效的轉(zhuǎn)化體系，穩(wěn)定的后代遺傳及簡單的遺傳背景，被廣泛的用于水稻突變體庫的構建。本研究通過農(nóng)桿菌介導的T-DNA隨機插入構建突變體庫，在正常栽培條件下種植T1代分離群體，目測篩選

2、有明顯突變表型的家系并進行突變表型與T-DNA純合插入共分離的檢測，并針對共分離家系，分離克隆相應基因并進行其功能分析。主要研究結果如下：
　　 1．創(chuàng)建獨立T-DNA轉(zhuǎn)化單株30，579株。
　　 2．篩選9，193個突變家系，觀察到有突變表型的家系1，417個，突變率為15.4％，得到3個共分離家系：03211UG73，03211UL95，03211UF78。突變性狀分別為：白化苗，半矮，完全不育。對03211UF7

3、8進行詳細的突變表型分析并分離克隆相應基因PAIR3。
　　 3.03Z11UF78家系分離出的不育突變體命名為pair3-1。相對于分離出的野生型單株，其突變體在營養(yǎng)生長階段及花序，花的發(fā)育都沒有任何差別；但在開花時，突變體的花藥不外露，至成熟時，突變體完全不育。KI-I2溶液染色顯示突變體的花粉粒幾乎全不著色，表明突變體雄性不育。野生型花藥做父本，pair3-1做母本，雜交不結實，表明突變體雌性也不育。
　　 4.0

4、3Z11UF78家系的T1代及T2代共分離檢測顯示完全不育的性狀與T-DNA純合插入完全共分離。
　　 5．從本室突變體庫中得到等位突變體05211HE71，命名為pair3-2，突變性狀也是完全不育，T1代共分離檢測也是完全共分離。
　　 6．轉(zhuǎn)雙鏈RNAi載體的轉(zhuǎn)化單株育性明顯降低，35％（21/60）單株為完全不育。部分單株取RNA做半定量PCR分析顯示：轉(zhuǎn)基因單株的育性與PAIR3基因的表達相對應。
　　

5、 7． RT-PCR及RACE確定PAIR3的基因序列。PAIR3基因在TIGR中編號為LOC_Os10g26560，基因全長為6，930bp（轉(zhuǎn)錄起始至終止），全長cDNA為2，963bp，由11個外顯子及10個內(nèi)含子組成，編碼一個包含844個氨基酸的蛋白。BLASTN分析顯示PAIR3基因是一個新基因，在已完成基因組測序的物種中沒有找到同源基因或蛋白。基因結構預測只有一個coiled-coil結構域。
　　 8．花藥半薄切片

6、顯示：相對于野生型花藥的發(fā)育，pair3花粉囊壁的發(fā)育沒有受到影響；花粉母細胞的發(fā)育及其隨后的小孢子也沒有明顯變化；但在花粉有絲分裂時期至成熟花粉時期，花粉粒皺褶、干癟，沒有活力。
　　 9．胚囊石蠟切片顯示：相對于野生型胚囊的發(fā)育，pair3胚囊在功能大孢子形成時期出現(xiàn)異常，大孢子減數(shù)分裂后靠近合點端的大孢子不是變大形成功能大孢子，而是隨著另三個靠近珠孔端的大孢子相繼降解而降解。最終突變體胚珠中沒有胚囊的結構，只見一些珠心組織

7、降解的痕跡。
　　 10．花粉壓片染色觀察突變體的減數(shù)分裂過程。結果顯示：pair3在終變期可見24條染色單體及后期Ⅰ染色體隨機分離。我們推測PAIR3基因通過影響水稻同源染色體的配對，造成性母細胞減數(shù)分裂中染色體的隨機分離，從而導致pair3雌雄性都不育。
　　 11．半定量PCR分析顯示：PAIR3基因在稻穗中有表達，在莖、葉、葉鞘等營養(yǎng)器官中不表達或很低水平的表達，這與突變體在營養(yǎng)階段沒有表型而只造成雌雄都不育相對

8、應；PAIR3基因在突變體（pair3-1和pair3-2）中都不表達，表明兩個等位突變體都是功能缺失（loss-of-function）的突變體；PAIR3基因在不同長度的穗子中都有表達，但是表達趨勢是先上升再下降，在穗長為4.5cm至11cm時表達最強，而這時正是性母細胞減數(shù)分裂時期。
　　 12．原位雜交結果顯示：PAIR3基因在花藥早期的花粉囊壁細胞及孢原細胞中有微弱表達，隨后在小孢子母細胞、四分體、剛游離出的小孢子中高

9、表達，在小孢子中表達慢慢降低至液泡化大孢子期完全不表達，之后又特異的在降解中的絨氈層中表達；PAIR3基因在胚囊早期的孢原細胞及珠被原基中有微弱表達，隨后在整個胚珠、珠柄、子房內(nèi)壁中表達，但主要是在大孢子母細胞減數(shù)分裂時或剛完成時表達最強。因此PAIR3基因主要是在減數(shù)分裂時期的性母細胞中高表達，表明．PAIR3在減數(shù)分裂中起作用。PAIR3表達模式與突變表型相對應。
　　 13．目前水稻中已報道的影響減數(shù)分裂的5個基因（PAI