1、花生是一種重要的油料作物，其種子富含蛋白質(zhì)和脂肪。花生種子中的貯藏性脂肪儲藏在被稱為油體的細(xì)胞器中。油體表面存在稱為油質(zhì)蛋白(Oleosin)的蛋白質(zhì)，它們在種子中高效表達(dá)，而在營養(yǎng)組織中沒有表達(dá)。本文的主要目的是從花生種子中克隆種子特異表達(dá)啟動子，為研究其表達(dá)調(diào)控機理提供序列資源，同時也為植物基因工程表達(dá)載體提供可供選擇的調(diào)控元件。另外，通過研究花生油質(zhì)蛋白基因在不同表達(dá)活性時其組蛋白修飾和裝配方面的差異，進(jìn)一步擴展對種子特異表達(dá)基因

2、調(diào)控機理的認(rèn)識。 采用定量RT—PCR技術(shù)，測定了4個花生油質(zhì)蛋白基因(AhOleo14.3、AhOleo16.9、AhOleo17.8和AhOleo18.5)在種子成熟過程中的轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果顯示它們的表達(dá)模式相似，即從種子成熟早期到成熟中后期，表達(dá)量不斷提高，種子成熟晚期的表達(dá)開始下降。利用銜接頭PCR方法克隆到AhOleo17.8和AhOleo18.5基因上游啟動子區(qū)片段，長度分別為1598bp和303bp。分析兩個啟動

3、子序列，發(fā)現(xiàn)存在轉(zhuǎn)錄需要的重要序列以及參與種子特異表達(dá)調(diào)控有關(guān)的順式元件，如RY元件、G框、E盒、AACAA元件等。將AhOleo17.8上游啟動子區(qū)序列及4段缺失序列分別接于載體pBI101.1的GUS基因上游。成功構(gòu)建插入5個AhOleo17.8啟動子缺失部分上游序列驅(qū)動GUS基因的載體(P-1598、P-1072、P—724、P—378和P-136)。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥得到轉(zhuǎn)化植株。對P-1072和P-136轉(zhuǎn)基因

4、的植株不同組織進(jìn)行GUS染色分析，發(fā)現(xiàn)P-1072檢測到GUS僅在種子中存在。對其種子進(jìn)行萌發(fā)后染色分析，檢測到GUS染色在植株萌發(fā)14-18天時基本消失。P-136在任何組織中都沒能檢測到GUS染色存在。上述結(jié)果說明，1072bp長的AhOleo17.8啟動子具有驅(qū)動基因在種子中特異表達(dá)的能力。 染色體免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)在成熟后期花生種子中油質(zhì)蛋白基因核心啟動子區(qū)和編碼區(qū)組蛋白H3占位水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于根莖葉中的水平。也就是說油質(zhì)蛋白

5、基因高效表達(dá)時，其核心啟動子和編碼區(qū)組蛋白發(fā)生了丟失。同時我們還觀察到組蛋白乙?；降牡南陆担@個結(jié)果是出乎我們意料的，因為乙酰化通常同基因表達(dá)正相關(guān)。但是，進(jìn)一步的實驗發(fā)現(xiàn)在種子發(fā)育早期，油質(zhì)蛋白基因核心啟動子和編碼區(qū)組蛋白H3確實發(fā)生了超乙?；?。表明乙?；瘏⑴c了該基因表達(dá)調(diào)控的早期階段。最后，實驗還發(fā)現(xiàn)根莖葉中油質(zhì)蛋白基因核心啟動子和編碼區(qū)組蛋白H3K9雙甲基化水平高于發(fā)育早期種子。因此H3K9雙甲基化參與了油質(zhì)蛋白基因在營養(yǎng)組織