1、答辯委員會(huì)主席： 堊態(tài)答辯委員會(huì)成員： 夏直拯堂圈羞論文答辯日期： 2 Q 1 2 生5 且1 8 目溫州I 醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文鈍頂螺旋藻耐鹽相關(guān)基因的發(fā)掘及其功能驗(yàn)證中文摘要目的本研究旨在| 三l 集胞藻P C C 6 9 0 3 為宿主，通過(guò)基囡敲除與回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，獲得鈍頂螺旋藻中耐鹽相關(guān)基因。同時(shí)利用G F P 作為報(bào)告基園建立p K W l l 8 8 同源重組雙交換平臺(tái)，研究螺旋藻耐鹽相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的起始轉(zhuǎn)錄功能，為后續(xù)鈍頂螺

2、旋藻耐鹽相關(guān)基因的研究奠定基礎(chǔ)。方法對(duì)螺旋藻蛋白質(zhì)組結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析得到耐鹽基因及其上游約2 5 0 b p D N A 序列。利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒( 啟動(dòng)子+ g 鏟} 卡那抗性篩選標(biāo)記) ，建立p K W l l 8 8 同源重組雙交換平臺(tái)，轉(zhuǎn)化集胞藻，在激光菇聚焦顯微鏡下測(cè)定其熒光強(qiáng)度，同時(shí)用熒光分光光度計(jì)測(cè)量不同鹽濃度下G F P 的誘導(dǎo)表達(dá)情況。同時(shí)構(gòu)建靶基因的敲除載體p L K R ( p M D 一，妒jk

3、a n ' ．' ．- r 嘞，) 及回補(bǔ)載體p K W - g e n e ：：C m 7 ．轉(zhuǎn)化集胞藻P C C 6 8 0 3 ，通過(guò)同源重組雙交換得到敲除藻及回補(bǔ)藻。利用分光光度計(jì)測(cè)定不同鹽濃度下藻的生長(zhǎng)情況，并以此來(lái)判斷差異表達(dá)基因是否為耐鹽相關(guān)基因。結(jié)果1 在預(yù)測(cè)螺旋藻耐鹽基因的啟動(dòng)子區(qū)域基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了3 個(gè)以p K W l 1 8 8為載體、含有螺旋藻啟動(dòng)子區(qū)域( p r o ) 、G F P 蛋白基因

4、( e ／p ) 和卡那霉素抗性基因( b a n ) 的重組載體( p K W - p r o ：：g f p ：：k a n r ) ，轉(zhuǎn)化集胞藻，并利用報(bào)告基因技術(shù)對(duì)這些啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了檢測(cè)．證實(shí)啟動(dòng)子p r o ．s p i - 0 4 9 ，p r o - 5 p i 一2 9 5 和p r o - s p i - 3 0 2 均具有起始轉(zhuǎn)錄活性，且可被N a C I誘導(dǎo)，驗(yàn)證了上述三個(gè)啟動(dòng)子具有啟動(dòng)功能。2 利用分子克

5、隆技術(shù)將1 2 個(gè)集胞藻基因的上下游1 0 0 0 b D 片段及卡那抗性基因克隆到p M D l 8 - T 載體，獲得了2 7 個(gè)含不同插入片段的克隆。同時(shí)得到8 個(gè)完整的敲除載體p L K R ( p M D —f P ^ ：：k a K ：：r i g h l ) 。3 敲除載體1 3 0 8 ．p L K R 轉(zhuǎn)化野生集胞藻得到靶基因，j ∞敲除的突變體藻，它在10 M N a C I 下不能生長(zhǎng)，初步推測(cè)該基因?yàn)槟望}相關(guān)基因