1、由于生態(tài)環(huán)境的不斷惡化、人為的過度捕殺等諸多因素的影響，導致很多野生動物品種滅絕或處于瀕臨滅絕狀態(tài)，品種的滅絕意味著進行細胞和分子生物學研究基本材料的永遠喪失。為此，從保護生物多樣性和保存種質(zhì)資源的實際出發(fā)，利用現(xiàn)代生物技術(shù)以構(gòu)建重要、瀕危動物品種群體細胞庫的方式來保存其基因資源，已成為21世紀諸多研究領(lǐng)域中至關(guān)重要的技術(shù)支撐和保障，具有深遠的科學意義。正常體細胞只能有限增殖，胚胎干細胞具有的無限分裂增殖特性，是保存基因遺傳資源的理想載

2、體。傳統(tǒng)的方法分離培養(yǎng)胚胎干細胞來源于囊胚的內(nèi)細胞團或生殖脊的原始生殖細胞，這對于野生動物來說取材相當困難。近年出現(xiàn)的轉(zhuǎn)導多能相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因誘導多能干細胞為卵母細胞和胚胎難以獲得的野生動物的保護帶來了新的希望。
　　 馬鹿(Re.deer)是分布最廣的鹿科動物，中國有8個亞種，天山亞種(C.elaphussongaricuss)主要分布在天山東部。近年由于自然環(huán)境變遷和開發(fā)利用，適合馬鹿棲息的生境不斷縮小，加之過度捕獵、牲畜爭

3、食等多種原因，主要馬鹿亞種資源野生狀況均不容樂觀，已被列入國家二級保護動物名錄。
　　 本課題利用現(xiàn)代生物技術(shù)，分離培養(yǎng)建立野生天山馬鹿皮膚成纖維細胞系，探討重編程野生天山馬鹿皮膚成纖維細胞，建立馬鹿多能性干細胞系的可能性，為野生動物保護探索新的方法和途徑，結(jié)果如下：
　　 (1)以DMEM(低糖)各DMEM/F12各45％+10％FBS+1.MEM非必需氨基酸+2mML-Glu+8.IU/ml慶大霉素為培養(yǎng)液，用組織塊

4、植塊培養(yǎng)成功從野生天山馬鹿耳朵皮膚分離培養(yǎng)得到原代馬鹿成纖維細胞(RDF)。利用對酶的敏感性不同對培養(yǎng)物進行了純化，得到典型的呈梭型的成纖維細胞系，細胞群體倍增時間為42.2.h。
　　 (2)用血清饑餓和培養(yǎng)到100％匯合度對RDF進行GO/G1期誘導，凋亡染色檢測結(jié)果表明血清饑餓后細胞凋亡顯著高于100％匯合度細胞，血清饑餓法不適于馬鹿細胞用于體細胞核移植前G0/G1期誘導。
　　 (3)從屠宰場獲得牛卵巢采集卵丘-

5、卵母細胞復合體培養(yǎng)1.h體外成熟，盲吸法去核后移植入RDF，電融合后用離子霉素和6-DMAP激活，在mSOF中培養(yǎng)，7d后得到種間核移植囊胚，證明成熟牛卵母細胞胞質(zhì)成分可以重編程RDF細胞核。與牛同種體細胞核移植胚胎相比，囊胚發(fā)育率低(15.1.V.22.5％)，囊胚細胞數(shù)少(68 V.83.8)。
　　 (4)以293T為包裝細胞，LipofectamineT.2000共轉(zhuǎn)染pMD.G、pCMVdeltaR8.91和LV-轉(zhuǎn)導

6、載體獲得了攜帶人轉(zhuǎn)錄因子OCT4，SOX2，NANOG和LIN28的慢病毒，ELISA測定滴度達到10.LPs/ml。將攜帶GFP的慢病毒感染RDF，與大鼠心臟細胞相比較，RDF對慢病毒不易感染。經(jīng)嘌呤霉素藥物篩選實驗及轉(zhuǎn)基因蛋白表達分析表明，用直接收獲的新鮮病毒液感染RDF(4.6×10.LPs/cell)，目的基因未在細胞中表達，以5倍劑量(2.3×105LPs/cell)感染RDF，有約50％細胞表達轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因后2周出現(xiàn)克隆樣