1、煙草基因組中NBS類抗性基因的分析,專 業(yè) 作 物 學(xué)答 辯 人 冷 曉 東指導(dǎo)教師 樊龍江教授,綜 述,煙草是一種重要的經(jīng)濟作物，煙草行業(yè)一方面能夠為國家增加稅收，同時對發(fā)展國民經(jīng)濟和滿足人民生活需要，都起了重大的作用。煙草作為模式植物，對于植物科學(xué)發(fā)展來說，無論是在基礎(chǔ)研究還是在應(yīng)用方面都起了很大作用，尤其是在遺傳、育

2、種、生理、生化以及采收后代謝方面。煙草也是研究植物病原互作最好的模式作物之一?？剐曰蛟谥参锱c病原互作過程中，起到非常重要的作用。所以對抗性基因的研究，無論對植物本身，還是對指導(dǎo)育種都有非常重要的意義。在煙草基因組測序的背景下，我們對煙草抗性基因進行了一些基礎(chǔ)性的研究。,研究過程,煙草基因組的分析 (基于TGI基因組序列)

3、 NBS類抗性基因的 生物信息學(xué)分析 煙草NBS類抗性基因 遺傳多態(tài)性分析

4、 NBS類抗性 與抗性基因連鎖的 基因家族分析 SSR分子標記的開發(fā),,關(guān)于TGI（Tobacco Genome I

5、nitiative http://tgi.ncsu.edu/）,,拼接去冗余后信息,所有數(shù)據(jù)來源,基因組序列：TGI EST序列：TGI Genebank ESTobacco (European Sequencing of Tobacco Project http://www.

6、estobacco.info/) TAB (Transcriptome Analysis of BY-2， http://mrg.psc.riken.go.jp/strc/),RGA（ Reistance gene analogue）的背景介紹,,I,II,III,IV,V,,,PK,,,,NBS,LRR,LZ/CC,,TIR,,TM,,PK,Pto,Mi

7、/Prf,Xa21,Cf4/Cf9,N,,NBS,,LRR,,LRR,,LRR,,TM,Representative gene,分析流程,,已知的NBS抗性基因,同源序列搜索,清理拼接,基因預(yù)測,蛋白預(yù)測,尋找結(jié)構(gòu)域,系統(tǒng)發(fā)育樹,已知的NBS類抗性基因,煙草基因組中鑒定出的NBS類基因結(jié)果統(tǒng)計,煙草基因組中30個NBS類基因的分類,,,煙草和其他植物間NBS類基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,藍色，綠色，紫色和黃色分別代表煙草，擬南芥，番茄和楊樹

8、,實驗部分,,PCR擴增產(chǎn)物,直接測序,克隆測序,遺傳多態(tài)性分析,基因家族系統(tǒng)進化分析,30對引物24個材料,本研究使用的煙草材料,,,注：抗性等信息來自中國作物種質(zhì)信息網(wǎng)（http://icgr.caas.net.cn）,引物設(shè)計位點,,植物抗性基因結(jié)構(gòu)和本研究引物設(shè)計位點。圖中標出了NBS功能域三個主要基序和C-和N-端通常具有的功能域，箭頭為本研究引物設(shè)計位點,本研究設(shè)計的30對煙草RGA引物,,,PCR產(chǎn)物直接測序鑒定的煙草RG

9、A基因,,得到如下遺傳多態(tài)性分析結(jié)論： 1、栽培與野生煙草之間存在明顯的遺傳多態(tài)性,栽培煙草與其野生祖先種（N.sylvestris）之間的分子多態(tài)性,注：括號中為累計長度（bp）,,2、栽培煙草RGA基因的遺傳多態(tài)性表現(xiàn)出極端的同質(zhì)性,克隆測序鑒定的煙草RGA基因家族,HHDJY:紅花大金元,煙草RGA基因亞家族的遺傳分化與進化,1 遺傳分化分析 對11個RGA家族內(nèi)成員遺傳分

10、化程度進行了分析：對這些 RGA基因家族成員分別進行建系統(tǒng)進化樹，根據(jù)樹型，有些樹分化程度明顯較大（如NBS334），表明這些亞家族內(nèi)部分化明顯。,A,B,C,D,E,F,G,H,基于RGA核苷酸序列和臨接法（NJ）構(gòu)建的煙草RGA基因4個亞家族的系統(tǒng)進化樹。A: NBS226; B: NBS173; C: NBS271; D: NBS374; E: Nbs359; F: NBS182; G: NBS334; H: NBS267,,2

11、進化分析 進一步對RGA亞家族選擇進化進行分析。RGA基因進化歷程可能是處于一種中性隨機突變狀況（M1a和M7模型）或受到正向或負向（又稱凈化）的選擇（M2a和M8模型）。根據(jù)Yang等（2005）方法(Yang et al., 2005)，我們可以估計煙草RGA基因亞家族成員的序列構(gòu)成符合哪個進化模式。結(jié)果表明 在測驗的8個RGA基因中，大多受到強烈的凈化選擇，同時部分基因在其個別位點上受到明顯的正向選擇。,煙草RGA基因

12、亞家族進化選擇測驗（似然比）結(jié)果,考慮到測序等誤差，所選用的每個RGA亞家族成員間序列差異度≥1% (Couch et al., 2006),煙草基因組RGA基因的系統(tǒng)進化關(guān)系,通過PCR產(chǎn)物直接測序和克隆測序，共獲得426條特異RGA基因序列，包括來自栽培煙草11個RGA家族的293條基因序列和19條野生煙草的基因序列。經(jīng)注釋，除了部分由于移碼、終止子等導(dǎo)致的假基因，其中絕大多數(shù)序列可以獲得完整的NBS蛋白質(zhì)序列。為了確定這些基因序列

13、的系統(tǒng)進化關(guān)系和亞家族歸屬，我們對獲得的所有序列和已知煙草和其他主要類型抗性基因進行了系統(tǒng)進化分析。從系統(tǒng)進化樹可以看出，我們鑒定的煙草RGA幾乎覆蓋了所以類型的已知抗性類型，包括TIR-NBS類和大量非TIR-NBS類基因。非TIR-NBS類基因中，煙草中一個煙草亞家族（I2，紅色部分）已進行一定數(shù)量的測序調(diào)查(Couch et al., 2006)，我們獲得的數(shù)據(jù)也同樣包含了這類RGA基因序列。同時，與已知抗性基因有較大差異的一批煙

14、草RGA被發(fā)現(xiàn)，這部分RGA基因表現(xiàn)出煙草RGA的特異性，其中部分可能是煙草特有的RGA。,基于RGA蛋白質(zhì)序列和臨接法（NJ）構(gòu)建的煙草RGA基因系統(tǒng)進化樹,圖中包括本研究獲得的煙草NBS類抗性基因（黑色）、GeneBank數(shù)據(jù)庫中已有煙草RGA基因序列（紅色）和目前已克隆抗性基因（其他顏色）。,煙草RGA類抗性基因SSR分子標記開發(fā),前期對煙草RGA基因進行了基因組分析，發(fā)現(xiàn)了一大批煙草RGA基因，遺傳多態(tài)性分析結(jié)果表明，煙草RGA

15、基因存在高度的遺傳同質(zhì)化，這給發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)RGA增加了難度。為了探索獲得與抗性相關(guān)RGA或相應(yīng)標記的高效途徑，本研究利用煙草基因組序列開發(fā)了與RGA緊密連鎖的SSR標記。,分子標記開發(fā)流程,,在基因組中查找含有RGA區(qū)段的序列,在其上下游尋找SSR序列,設(shè)計引物,23個煙草材料中進行PCR擴增,用于開發(fā)煙草SSR標記的23個栽培煙草品種及其野生種基本信息,注：黑：黑莖??；青：青枯病；根：根結(jié)線蟲??；CMV:煙草花葉病毒病；蚜：煙蚜

16、； -：感?。?-：中感；---：高感。+：抗病；++：中抗。O：耐病。,開發(fā)煙草中與RGA相關(guān)的SSR標記設(shè)計的引物,,,開發(fā)的與RGA基因相關(guān)的SSR標記列表,,討論： 1、實驗結(jié)果表明，在設(shè)計的43對引物中，能夠用于 分子標記的引物有8對，NBS連鎖的SSR標記的開發(fā) 效率達到近20%,是一種開發(fā)抗性基因分子標記的 有效途徑。 2