1、超聲微泡攜MAGLshRNA靶向釋放對(duì)大鼠肝細(xì)胞肝癌轉(zhuǎn)移作用的實(shí)驗(yàn)研究陳懿1王曉波2張俊勇1連崢嶸1龔建平1【摘要】目的觀察超聲微泡攜單?；视椭久赋聊颍╩onoacylglycerollipaseshthairpinRNAMAGLshRNA)在大鼠肝細(xì)胞肝癌（hepatocellularcarcinomaHCC)組織中轉(zhuǎn)染及對(duì)HCC轉(zhuǎn)移的作用。方法建立大鼠肝細(xì)胞肝癌模型，病理解剖和二維超聲驗(yàn)證肝臟成瘤情況。抽取48只SD大鼠隨機(jī)

2、分成四組，分別為PBS液組、MAGLshRNA質(zhì)粒微泡組(MAGLshRNAmicrobubbleMB)、空白質(zhì)粒微泡超聲輻照組(microbubblesultrasoundMBUS)、MAGLshRNA質(zhì)粒微泡超聲輻照組(MAGLshRNAMBUS)。每只注射1ml，對(duì)MBUS組和MAGLshRNAMBUS組大鼠肝區(qū)同時(shí)給予超聲輻照，輻照條件為300kHz，2Wcm2，輻照10s，間隔10s，共20min。WesternBlot檢測(cè)大

3、鼠HCC組織MAGL蛋白的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)MAGL和基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrixmetalloproteinase2MMP2）的表達(dá)。比較各組動(dòng)物的腫瘤轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果MAGL在HCC組織中表達(dá)明顯高于正常肝組織(P0.05)；微泡攜MAGLshRNA可以在HCC組織被超聲輻照擊破后靶向釋放，在各組HCC組織中均有MAGL蛋白的表達(dá)，其中MAGLshRNAMBUS組表達(dá)量明顯低于其它組(P0.01)；免疫組化檢測(cè)MAGLshRNAMB

4、US組MMP2表達(dá)均低于其它組(P0.01)；各組動(dòng)物均見腫瘤轉(zhuǎn)移，但MAGLshRNAMBUS組轉(zhuǎn)移率最低(P0.01)。結(jié)論超聲輻照可破壞攜MAGLshRNA的微泡使之靶向釋放并增強(qiáng)了MAGLshRNA的轉(zhuǎn)染效率，MAGLMMP2通路可能與HCC的轉(zhuǎn)移相關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】肝細(xì)胞肝癌；單?；视椭久?；基因；超聲微泡；轉(zhuǎn)移——————————————基金項(xiàng)目：重慶市衛(wèi)生局重點(diǎn)科研項(xiàng)目（20111123）（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外

5、科400010；2.重慶市涪陵中心醫(yī)院肝膽外科408000）[作者簡介作者簡介]陳懿（19874），男，四川成都人，研究方向：肝膽外科學(xué)，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科。Tel：13637970778Email:chenyi9587@[通訊作者通訊作者]龔建平（196111），男，四川宜賓人，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：肝膽外科學(xué)，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科。Tel：13996286589Email:gongjianping

6、11@單?；视椭久福∕onoacylglycerollipaseMAGL）是一種脂代謝關(guān)鍵酶，其在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，以及增加惡性程度上有重要作用，以RNA干擾和JZL184藥理學(xué)阻斷MAGL后腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移明顯被抑制【12】。研究表明，肥胖和脂質(zhì)代謝紊亂是肝細(xì)胞肝癌（HepatocellularcarcinomaHCC)發(fā)生的高危因素【3】，且肝炎病毒感染造成的脂代謝異常以及非酒精性肝脂肪變均有可能是HCC發(fā)生發(fā)展的根本原因【4】。

7、HCC的轉(zhuǎn)移仍是患者術(shù)后長期存活的主要障礙，目前尚無有效的治療手段預(yù)防HCC的轉(zhuǎn)移。近年來超聲輻照破壞攜靶基因的微泡定向釋放技術(shù)以它的無創(chuàng)、安全、高效、靶向性好及不引起免疫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為肝癌基因治療的熱點(diǎn)和方向【5.6】。本研究通過超聲微泡技術(shù)靶向轉(zhuǎn)染MAGLshRNA，特異性抑制HCC細(xì)胞內(nèi)MAGL的表達(dá)，探究以MAGL為靶點(diǎn)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝為手段抑制HCC轉(zhuǎn)移的可行性以及機(jī)制。1.材料及方法1.1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SPF級(jí)雄性SD大鼠

8、60只，體質(zhì)量(216.516.2)g8周齡，購自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。所有動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，采用標(biāo)準(zhǔn)化光照，自由飲水、進(jìn)食，定期更換墊料，適應(yīng)環(huán)境1周。動(dòng)物使用許可證號(hào):CQLA20112443。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)大鼠的飼養(yǎng)和處置均遵循《重慶市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法》。1.2.主要儀器及試劑：752型紫外分光光度儀購自日本島津公司，CGZZ型超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀(1MHz)為重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所研制，自制脂質(zhì)

9、微泡為重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所惠贈(zèng)。MAGLshRNA質(zhì)粒購自美國SantaCruz公司，GIGA質(zhì)粒試劑盒購自美國Qiagen公司，多聚賴氨酸購自美國Sigma公司。二乙基亞硝胺(DEN)，純度為99.5%，購自美國Sigma公司?？筂AGL抗體購自英國Abcam公司，抗MMP2抗體購自武漢三鷹公司。1.3.大鼠肝癌模型的建立：大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，從第2周開始給予體積分?jǐn)?shù)0.2%DEN（500ml生理鹽水加1mlDEN，振蕩混勻，

10、避光保存）溶液灌胃，按體質(zhì)量10mgKg給藥，5次周，至14周停藥。建模后60只大鼠隨機(jī)處理5只，給予肝區(qū)二維B超檢測(cè)后收集大鼠腫瘤組織作常規(guī)切片，HE染色，經(jīng)病理診斷均為肝細(xì)胞癌，即建立大鼠HCC模型成功。剩余大鼠隨機(jī)抽取48只分成4組：分別為PBS液組、MAGLshRNA質(zhì)粒微泡組(MAGLshRNAMB)、空白質(zhì)粒微泡超聲輻照組(MBUS)、MAGLshRNA質(zhì)粒微泡超聲輻照組(MAGLshRNAMBUS)。1.4.質(zhì)粒提取及攜M

11、AGLshRNA基因微泡的合成：MAGLshRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌；經(jīng)氨芐西林篩選出陽性克隆，在LB培養(yǎng)基中大量擴(kuò)增細(xì)菌；參照GIGA質(zhì)粒抽提試劑盒說明書大量抽提純化質(zhì)粒；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒濃度和純度，調(diào)整濃度為1mgml，A260A280=1.9，其純度符合實(shí)驗(yàn)要求。參照文獻(xiàn)【7】的方法制備載有MAGLshRNA及賴氨酸的超聲微泡造影劑，調(diào)整濃度為0.1μgμl。1.5.治療方法：第15周開始經(jīng)大鼠尾靜脈注射入載有MAG

12、LshRNA質(zhì)粒的微泡1ml?？瞻踪|(zhì)粒微泡超聲輻照組和MAGLshRNA質(zhì)粒微泡超聲輻照組注射后采用超聲監(jiān)測(cè)微泡到達(dá)靶組織的情況，輻照條件為300kHz，2Wcm2，輻照10s，間隔10s，共20min【8】。1.6.檢測(cè)指標(biāo)：（1）建模后腫瘤超聲、腫瘤標(biāo)本及病理觀察：60只大鼠隨機(jī)處理5只，給予二維B超檢測(cè)后收集大鼠肝癌組織及正常肝組織，常規(guī)石蠟切片，HE染色觀察腫瘤組織的病理學(xué)變化情況，采用免疫組織化學(xué)二步法進(jìn)行染色檢測(cè)MAGL蛋白

13、在HCC組織及正常組織中的表達(dá)。(2)WesternBlot檢測(cè)MAGL蛋白的表達(dá)情況：轉(zhuǎn)染1周后，每組各處死5只大鼠采用WesternBlot檢測(cè)MAGL蛋白的表達(dá)情況，操作按常規(guī)方法進(jìn)行：收集大鼠肝癌組織，提取總蛋白，20℃保存。配膠后加入預(yù)染蛋白和樣本總蛋白，對(duì)各泳道等量上樣行電泳，同步化將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉4h，依次加入一抗，4℃孵育過夜，洗膜，加二抗，室溫下孵育2h，洗膜，顯影，采用QuantityOne

14、軟件分析各組MAGL與內(nèi)參βactin的表達(dá)。(3)轉(zhuǎn)染后腫瘤組織病理學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)染色：處死大鼠后取出腫瘤組織用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片；HE染色，觀察腫瘤組織的病理學(xué)變化情況。經(jīng)蘇木精伊紅染色病理檢查確診后均采用免疫組織化學(xué)二步法進(jìn)行染色檢測(cè)MMP2的表達(dá)。(4)動(dòng)物腫瘤轉(zhuǎn)移情況：每組剩下的7只大鼠喂養(yǎng)至自然死亡，觀察其腫瘤的轉(zhuǎn)移情況（包括腹壁轉(zhuǎn)移、結(jié)腸轉(zhuǎn)移、胃轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移等），比較每組大鼠轉(zhuǎn)移率的差異，轉(zhuǎn)移率=每組