1、專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),㈠.微生物的類群,微生物,原核類:,真核類,非細(xì)胞類：,,細(xì)菌、支原體、放線菌、藍(lán)藻,個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡單,酵母菌、霉菌、食用菌,,真菌：,原生生物：,顯微藻類、原生生物（如：草履蟲、變形蟲等）,病毒、類病毒、朊病毒,◆微生物的共同特點(diǎn)：,一.微生物基礎(chǔ)知識,1.細(xì)菌的形態(tài),細(xì)菌主要是以二分裂的方式進(jìn)行增殖（如右圖）,2.細(xì)菌的繁殖,3.細(xì)菌的菌落,⑴.定義：,單個(gè)或者少數(shù)細(xì)菌在固體

2、培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，會形成一個(gè)肉眼可見的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。,⑵.特征：,大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等。,⑶.功能：,每種細(xì)菌在一定條件下所形成的菌落，可以作為菌種鑒定的重要依據(jù)。,幾種菌落及其形態(tài),幾種菌落及其形態(tài),4.病毒的結(jié)構(gòu),:由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。,病毒的結(jié)構(gòu),吸附,,注入,合成,,釋放,組裝,5.病毒的繁殖,,,,病毒的增殖一般可分五個(gè)階段，即：吸附→注入核酸→合成核酸和蛋白質(zhì)→組裝→釋放,

3、6.病毒的營養(yǎng)方式,：寄生,,微生物需要的五大類營養(yǎng)要素物質(zhì)是：,㈡.微生物需要的營養(yǎng)物質(zhì)及功能,1.碳源 2.氮源 3.生長因子 4.無機(jī)鹽 5.水,：凡是能為微生物提供所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)。,①無機(jī)碳源：CO2；NaHCO3等,②有機(jī)碳源：糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等,①構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物②異養(yǎng)微生物的能源,⑴.概念,⑵.來源：,⑶.作用：,1.微生物的碳源,①無機(jī)氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。,②有機(jī)氮源：

4、尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等,凡是能夠?yàn)槲⑸锾峁㎞元素的營養(yǎng)物質(zhì)。,主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸及含N的代謝產(chǎn)物。,2.微生物的氮源,⑴.概念：,⑵.來源：,⑶.作用：,3.生長因子,⑶.常見的生長因子：,⑴.概念：,⑵.作用：,微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物。,酶和核酸的組成成分。,維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。,㈢.培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的營養(yǎng)基質(zhì)。,1.培養(yǎng)基的類型和用途,2.不同的

5、微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方(參考教材附錄內(nèi)容),3.不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、氮源、無機(jī)鹽、等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細(xì)菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。,培養(yǎng)基的種類,不加凝固劑,加凝固劑，如瓊脂,工業(yè)生產(chǎn),觀察微生物的運(yùn)動、分類鑒定,微生物分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種,含化學(xué)成分不明確的天然物

6、質(zhì),工業(yè)生產(chǎn),培養(yǎng)基成分明確,分類、鑒定,在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長,促進(jìn)所需要的微生物的生長,培養(yǎng)、分離出特定微生物,在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類的微生物,鑒別不同種類微生物,選擇培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,半固體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基：,表面生長,均勻混濁生長,沉淀生長,back,半固體培養(yǎng)基：,,,(是否運(yùn)動),無動力,有動力(彌散),固體培養(yǎng)基：菌落,分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)

7、胞,幾種選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基,分離酵母菌、霉菌等真菌,不加氮源的無氮培養(yǎng)基,分離固氮菌,不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基,分離自養(yǎng)型微生物,加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基,back,血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子； ③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分,人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基

8、（如血清）。,㈣.無菌技術(shù),1.無菌技術(shù)的概念,無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。,⑴消毒定義： 利用化學(xué)或物理方法，殺死部份微生物的過程。,2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別,⑵滅菌的定義：,以化學(xué)試劑或物理方法消滅所有微生物，包括所有細(xì)菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達(dá)到完全無菌之過程。 滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。,①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。②巴氏消

9、毒法：70-75℃下煮30min或 80℃下煮15min。③化學(xué)藥劑消毒法：用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒；氯氣消毒水源。④紫外線消毒。,⑴.消毒的方法：,3.常用的消毒與滅菌的方法,①灼燒滅菌②干熱滅菌：160-170 ℃下加熱1-2h。③高壓蒸氣滅菌：100kPa、121 ℃下維持15-30min.,⑵.滅菌的方法：,最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時(shí)可以基本

10、保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。 有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。 而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計(jì)的。,1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？,2.請你判斷以下材料或用

11、具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。⑴培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿⑵玻棒、試管、燒瓶和吸管⑶實(shí)驗(yàn)操作者的雙手,答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,P15——16旁欄思考,二.實(shí)驗(yàn)操作(以培養(yǎng)大腸桿菌為例),㈠.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,1.計(jì)算2.稱量3.溶化4.滅菌: 將錐形瓶放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～3

12、0min。5.倒平板: 待培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種。,倒平板操作,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？,答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,問題討論,1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 ℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？,3.平板冷凝后，

13、為什么要將平板倒置？,4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。,㈡.純化大腸桿菌,平板劃線法和稀釋涂布平板法。,微生物的接種

14、的常用接種方法有：,1.平板劃線的操作方法,平板劃線的操作,,,,一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無法形成規(guī)則的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個(gè)條狀的菌落。,,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次

15、劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,問題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線

16、條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。,2.稀釋涂布平板的操作方法,答：應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。,問題討論,涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？,4.菌種的保存,接種到固體斜面培養(yǎng)基，

17、菌落長成后置于4℃冰箱保存。,3.微生物的恒溫培養(yǎng),⑵.長期保存：,甘油冷凍管藏法,⑴.臨時(shí)保藏：,三.結(jié)果分析與評價(jià),㈠.培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。㈡.接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)

18、到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。㈢.是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時(shí)觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。,代謝類型,光能無機(jī)營養(yǎng)(光能自養(yǎng)型),光能有機(jī)營養(yǎng)(光能異養(yǎng)型),化能無機(jī)營養(yǎng)(化能自養(yǎng)型),化能有機(jī)營養(yǎng)(化能異養(yǎng)型),光,光,無機(jī)物,有機(jī)物,無機(jī)物,有機(jī)物,無機(jī)物,有機(jī)物,二氧化碳,二氧化碳及簡單有機(jī)物,二氧化碳,有機(jī)物,大多數(shù)已知細(xì)菌和全部真核

19、微生物,硝化細(xì)菌氫細(xì)菌,紫色非硫細(xì)菌,藍(lán)細(xì)菌綠色硫細(xì)菌藻類,本課題知識小結(jié):,【典例解析】,例:關(guān)于微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是( ) A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽 D.無機(jī)氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項(xiàng)，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時(shí)

20、是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有的碳源同時(shí)是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項(xiàng)，除水以外的無機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無機(jī)鹽。對于D選項(xiàng)，無機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。,D,例2：下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是( ) A.防止雜菌污染 B

21、.消滅雜菌 C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前,解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因?yàn)榘l(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個(gè)發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯(cuò)誤的，因?yàn)闇缇哪康氖欠乐闺s菌污染，但實(shí)際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因?yàn)榕c發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果