1、肝細胞死亡的基礎與臨床研究,同濟醫(yī)院感染性疾病研究所同濟醫(yī)院感染科寧琴 教授,,,,,內容,肝細胞死亡的模式,肝細胞死亡與肝臟疾病,肝細胞死亡的調控,結論,1,2,3,4,凋亡啟動原因 死亡受體/配體 DNA損傷 生長因子缺乏主動過程程序性細胞死亡,壞死繼發(fā)于 重型病毒性肝炎 缺血/再灌注損傷 急性藥物性肝炎被動過程

2、 顯著的炎癥反應,肝細胞死亡的模式,,,,,肝細胞死亡,細胞壞死與凋亡的形態(tài)區(qū)別,舊觀點凋亡與壞死被認為是兩種截然不同的現(xiàn)象 新觀點凋亡與壞死是源于相同啟動因素和信號轉導途徑的不同的細胞死亡方式，而線粒體功能損傷在這一過程中起到關鍵的連接作用。,,,,線粒體是細胞生命活動的控制中心,,氧化磷酸化中心,細胞凋亡調控中心,細胞呼吸鏈中心,線粒體,,,,凋亡存在兩條不同的信號傳導途徑,一類細胞中含有足

3、夠的Caspase8可被經(jīng)典的死亡受體活化，直接激活效應Caspase；另一類細胞其死亡受體介導的Caspase8活化不能達到很高的水平，凋亡信號需要借助線粒體途徑來放大，而細胞色素C的釋放是這一途徑的關鍵步驟。,線粒體在凋亡中的作用,缺血再灌注，肝細胞毒素（N-乙酰苯醌亞胺 NAPQI ，膽酸，死亡受體活化等） 集中作用于線粒體，導致其膜透化。 Bcl2家族成員包括caspase 8 活化形成的tBid,導致外膜透化。其透化可

4、能包括外膜通道的形成或是線粒體腫脹破裂后誘導MPT。 其他應激因素可直接導致MPT.膜透化后，細胞色素C釋放相繼激活caspase 9 和caspase 3，從而誘導細胞凋亡 。而由于線粒體功能的嚴重異常，ATP減少，caspase 活化被阻斷則會發(fā)生壞死。,壞死和凋亡是線粒體透化的不同結果,肝細胞死亡與肝臟疾病,1.死亡受體/配體誘導的肝細胞損傷,目前認為在肝臟中發(fā)揮重要作用的死亡受體主要包括Fas、TNFR1及TRAIL-R1

5、/R2，后者與它們相應的配體FasL、TNFα和TRAIL結合后可誘導受體發(fā)生寡聚化并活化其胞內的死亡結構域，與相應的連接蛋白相互作用進而觸發(fā)凋亡的級聯(lián)反應。,1.死亡受體/配體誘導的肝細胞損傷,1）Fas/FasL誘導的肝細胞損傷,Fas在肝實質細胞、血竇內皮細胞、星狀細胞及枯否氏細胞上具有廣泛的表達。 自然殺傷細（NK）和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）可通過分泌FasL啟動凋亡程序來清除病毒感染 的肝細胞或腫瘤細胞。,

6、NK細胞殺傷自身肝細胞的機制,Hepatology. 2004J Exp Med. 2007Hepatology. 2007,CTL細胞對肝細胞的殺傷作用,1）Fas/FasL誘導的肝細胞損傷,研究發(fā)現(xiàn) 乙型、丙型病毒性肝炎患者體內可溶性Fas的表達有所增加，且表達水平與疾病活動度及治療應答反應相關。 當HCV特異性的FasL表達的CTL被動移植至穩(wěn)定表達HCV結構蛋白的小鼠體內后，小鼠肝細胞出現(xiàn)損傷，血清谷丙轉氨酶（ALT）

7、水平升高。在HBV轉基因小鼠中，HBV特異性CTL也能導致急性肝損傷甚至肝衰竭 酒精性肝炎患者的血清中可以發(fā)現(xiàn)其可溶性Fas的表達也是上調的 酒精和HCV病毒可在Fas信號轉導途徑誘導的肝臟損傷中發(fā)揮協(xié)同作用 非酒精性脂肪肝患者中，其Fas的表達和肝細胞凋亡的發(fā)生也是增加的。 Fas誘導的凋亡在暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展中也占有一席之地,2）TRAILR/TRAIL誘導的肝細胞損傷,研究發(fā)現(xiàn)病毒性肝炎患者中其血清TRAIL的表

8、達水平顯著增高；小鼠肝細胞在病毒感染后也能誘導上調TRAIL的表達，通過TRAILR/TRAIL途徑誘導感染肝細胞的凋亡。,Fas 和 TRAIL 受體信號,Fas 和TRAIL 的死亡誘導信號復合物 (DISC) 類似. TRAILR1/TRAIL-R2或Fas 與其配體 TRAIL或FasL結合后，通過與死亡結構域(DD)的同型反應招募調節(jié)蛋白FADD。FADD 包含死亡效應結構域(DED)，可招募并分裂procasp

9、ase 8 和10, 使其活化。Caspase 8 將Bid分裂為tBid，致使線粒體透化，功能失常和凋亡。,,,3）TNFR1/TNFα誘導的肝細胞損傷,正常肝細胞中TNFR1的表達水平很低，但各種急慢性肝臟疾病中，TNFR1會在肝實質細胞、血竇內皮細胞和炎性浸潤細胞中大量表達。除了誘導凋亡途徑，TNFα還能通過NFκB依賴的基因表達途徑促進肝細胞的增殖，在部分肝切除后肝細胞的再生中起重要作用。 TNFR表達過量時會導致

10、肝細胞損傷加劇而肝臟再生失敗。,3）TNFR1/TNFα誘導的肝細胞損傷,在肝臟移植中，供體與受體的TNFR1發(fā)揮相反的效應，表現(xiàn)為供體TNFR1的缺陷可加劇移植物的損傷，而受體TNFR1缺陷時肝損傷有所緩和且炎性細胞浸潤減少。在酒精性肝炎患者中，其血清TNFα和TNFR1的水平均上升并與死亡率相關。病毒性肝炎患者中，其TNFα的水平與治療應答反應呈負相關。,TNFa受體介導的信號,TNF與TNFR結合后，與TRADD, RIP,

11、TRAF-2共同形成Complex I，激活 NFkB 和JNK. NFkB 激活某些survival gene(包括抗凋亡蛋白c-FLIP, IAPs, Bcl-XL和 A1)的轉錄。 Complex I 經(jīng)過修飾和內化形成Complex II (DISC) ,后通過與DD的相互作用及激活procaspase 8來招募FADD（Fas相關死亡結構域）?；罨?caspase 8 將Bid （促凋亡蛋白）分裂為 tBid, 轉移至線粒體

12、后導致其透化，功能障礙及凋亡。,2.穿孔素/顆粒酶誘導的肝細胞損傷,穿孔素(perforin)主要存在于CTL和NK細胞的胞漿中,是CTL和NK細胞發(fā)揮細胞毒效應的另一重要途徑。,2.穿孔素/顆粒酶誘導的肝細胞損傷,穿孔素可在靶細胞膜上形成跨膜孔道 1）引起細胞滲透性改 變、鈣離子內流和能 量的耗竭，導致靶細 胞融解和細胞死亡。 2）穿孔素形成的跨膜通 道可以使顆粒酶

13、 （granzyme）進入靶 細胞，顆粒酶進一步 通過蛋白水解激活 Caspase家族的某些 成員觸發(fā)Caspase級 聯(lián)反應，導致靶細胞 凋亡。,2.穿孔素/顆粒酶誘導的肝細胞損傷,研究發(fā)現(xiàn)，穿孔素在慢性乙肝肝細胞損傷中發(fā)揮了重要的作用，也是慢性丙肝患者肝細胞損傷的主要效應分子。,3.缺血/缺氧誘導的肝細胞損傷,1.缺血-再灌注損傷

14、 2.免疫凝血途徑誘導的肝細胞壞死,1）缺血-再灌注損傷,發(fā)生于肝臟的缺血-再灌注損傷可分為兩個階段:第一階段 反映了直接的肝細胞損傷。第二階段 涉及到天然免疫系統(tǒng)的激活，特別是缺血后肝 臟枯否氏細胞的活化，以及中性粒細胞、淋巴 細胞的炎性浸潤。,缺血-再灌注損傷,在肝細胞的體外熱缺血-再灌注損傷模型中 ，肝細胞急劇腫脹壞死。 體內肝臟發(fā)生缺血-再灌注損傷

15、后，其急性階段也主要表現(xiàn)為肝細胞的壞死。,缺血-再灌注損傷,其他觀點 缺血-再灌注損傷后，肝細胞的凋亡和壞死是并存的，損傷的強度和持續(xù)時間決定了細胞的死亡方式，即嚴重的損傷會導致早期發(fā)生的肝細胞壞死，而輕度的損傷則發(fā)生延遲的凋亡反應。,免疫凝血途徑誘導的肝細胞壞死,免疫凝血途徑誘導的肝細胞壞死,系列研究發(fā)現(xiàn)，活化巨噬細胞（內皮細胞）/fgl2凝血酶原酶介導的免疫凝血途徑可通過促進肝臟纖維素沉積和微血栓形成引發(fā)肝臟的微循環(huán)障礙，最終

16、肝細胞 缺血缺氧，ATP合成障礙而觸發(fā)肝細胞壞死的發(fā)生。,J Virol, 1997, J Immunol 1998, J Clin Invest 2003, 中華醫(yī)學雜志２００３ W J G 2006, Human Gene Therapy 2006，中化肝臟病雜志?。玻埃埃?，２００７J Biol Chem. 1999, and J Biol Chem 2003,肝內枯否氏細胞、內皮細胞fgl2高表達，是暴發(fā)性肝炎肝細胞壞死的重

17、要機制,膽酸誘導的肝細胞損傷,體外細胞培養(yǎng)體系中，毒性膽鹽可以通過Fas或TRAIL依賴的途徑引起肝細胞凋亡。 在急性膽汁淤積的發(fā)生中，F(xiàn)as及其他信號途徑也能導致嚴重的線粒體功能障礙及ATP的耗竭，促進細胞壞死的發(fā)生。,藥物誘導的肝細胞損傷,在美國對乙酰氨基酚的過量使用是造成急性藥物性肝損傷的主要原因 肝細胞凋亡與壞死共存于對乙酰氨基酚誘導的肝損傷： 1）當藥物造成了ATP的完全耗竭，肝細胞壞死發(fā)生；

18、 2）當D-果糖與甘氨酸的運用減緩了ATP的耗竭，則Caspase誘導的凋亡途徑占優(yōu)勢。,肝細胞死亡的調控,1. 正常肝細胞死亡的干預2. 異常肝細胞死亡的誘導,正常肝細胞死亡的干預,Caspase抑制劑抗氧化劑凋亡壞死關鍵基因的RNA干擾細胞因子中草藥 血漿置換,異常肝細胞死亡的誘導,選擇性的增加腫瘤細胞對于TRAIL介導的凋亡途徑的敏感性，有助于清除肝臟腫瘤細胞，保護正常的肝細胞。 通過藥物和基因干預手段靶向誘導