1、DNARNA的提取、純化與鑒定的提取、純化與鑒定編輯詞條編輯詞條發(fā)表評論發(fā)表評論(0)目錄??DNA的提取純化??基因組DNA的提取??從植物組織提取基因組DNA??從動物組織提取基因組DNA??細菌基因組DNA的制備??基因組DNA的檢測??組織DNA的提取和純化??石蠟包埋組織的DNA提取及其應(yīng)用??外周血DNA提取技術(shù)??真核細胞DNA的制備??植物組織中DNA的提取??細菌DNA的提取方法??真菌DNA提取總結(jié)的兩種方法??組織

2、mRNA提取操作步驟??RNA酶活性的控制??用異硫氰酸胍和有機溶劑提取RNA??mRNA的分離??哺乳動物細胞總RNA的分離??植物總RNA的分離??植物mRNA的分離??PCR常見問題分析??瓊脂糖凝膠DNA回收常見問題分析??RNA提取常見問題分析??DNA電泳常見問題分析??質(zhì)粒提取常見問題分析??凝膠電泳操作注意事項??實驗：DNA片段的回收及純化??實驗：RNA的提取及其純度檢測[顯示部分]DNA的提取純化編輯本段回目錄一、

3、細菌培養(yǎng)物的生長從瓊脂平板上挑取一個單菌落，接種到培養(yǎng)物中(有含有行當抗生素的液體培養(yǎng)基中生長)，然后從中純化質(zhì)粒，質(zhì)粒的提純幾乎總是如此。現(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如pUC系列）都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標準LB培養(yǎng)基中生長到對數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。此時，不必造反性地擴增質(zhì)粒DNA。然而，較長一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復(fù)制，所以需要在得到部分生長的細菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時，以便對

4、質(zhì)粒進行性擴增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成，結(jié)果阻止了細菌染色體的復(fù)制，然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，在若干小時內(nèi)，其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣，像pBR322－類的質(zhì)粒，從經(jīng)氯霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同，前者大為增高。多年來，加入足以完全抑制蛋白質(zhì)合成的氯霉素(μgml)已繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達到飽和(每２個堿基對大約結(jié)合１個溴化乙錠分子)（Ｃant和Ｓchimmel1980）。

5、由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA的首選方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。盡管這些方法大多數(shù)均被束之高閣，但其中最好的方法，也應(yīng)是聚乙二醇分級沉淀法，最近已得到改進（R.Treisman個人通訊）并達到較高

6、境界，使用該方法可得到極高純度的質(zhì)粒。聚乙二醇分級沉淀法與氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法有一點不同，那就是不能有效地把帶切口的環(huán)狀分子同閉環(huán)質(zhì)粒DNA分開，因此，純化容易帶上切口的極大質(zhì)粒（大于15kb）及用于生物物理學(xué)測定的閉環(huán)質(zhì)粒時、平衡離心仍是首選的方法。然而，兩種純化方法都可得到足可勝任分子克隆中各種復(fù)雜工作的質(zhì)粒DNA，包括用于哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染以及利用外切核酸酶產(chǎn)生成套的缺失突變體?？尚遥瑢τ诟Ｒ?guī)的操作，則可全然免卻進一步

7、提純的問題。目前所用的質(zhì)粒大多數(shù)復(fù)制量大，小量制備質(zhì)粒即可得到足量的DNA完成以下種種工作；限制酶圖的繪制、細菌轉(zhuǎn)化、特定DNA片段的分離、常規(guī)亞克隆及放射性標記探針的制備。四、質(zhì)粒DNA的小量制備一）細菌的收獲和裂解１、收獲１）將2ml含相應(yīng)抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。2）將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機于4℃以12000g離心30秒，將剩

8、余的培養(yǎng)物貯存于4℃。3）吸去培養(yǎng)液，使細菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。2、煮沸裂解該法根據(jù)Ｈolmex和Quigley(1985)的方法改進而成。1）將細菌沉淀[收獲細菌和步驟３）所得]重懸于350μlSTET中。STET0.1molLNaC10mmolLTris.Cl(pH8