1、免疫組化步驟免疫組化步驟一般的sp法步驟啊，具體如下：1、烤片，68℃，20分鐘，2.脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯二甲苯100%酒精100%酒精95%酒精90%酒精80%酒精70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯依據(jù)的是相似相溶的原理.一般在每個(gè)試劑中放10min天氣熱可以少放幾分鐘相反天氣較冷的話就要適當(dāng)延長脫蠟時(shí)間一般為1215min.3.抗原修復(fù)：脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間，加入3%H2O2甲醇溶液浸泡10min，從而除去內(nèi)源性的過

2、氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來。4.血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來，然后放入37C溫箱中半小時(shí)。血清稀釋10倍（900lPBS：100l血清封閉液）

3、。5.加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，不洗，加一抗，如果做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，就在對(duì)照的組織上加PBS。加完一抗后于4C冰箱中保存過夜(≥18h)。6.加二抗：將載玻片從冰箱中取出，4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗然后置于37C溫箱中半小時(shí)。7.加SABC:將片子從溫箱中取出放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC

4、然后置于37C溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍（990lPBS：10lSABC）。8.加顯色劑：將片子從溫箱中取出放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）A：DABB：H2O2C：磷酸緩沖液9.復(fù)染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動(dòng)物組織為半分鐘，植物組織35min。然后鹽酸酒精

5、分化。10.脫水：將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精80%酒精90%酒精95%酒精100%酒精100%酒精二甲苯二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通風(fēng)柜中。11.封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。免疫組化技術(shù)要點(diǎn)免疫組化技術(shù)要點(diǎn)1.固定固定最好用4%的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片，甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好；

6、但對(duì)于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液，請(qǐng)于購置前注意說明書。（1）BouinS固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的長期保存。（2）PLP液：即高碘酸鈉賴氨酸多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。2.微波中高火68m

7、in。3.室溫冷卻。4.用PBS洗滌3次，每次5min。二、蛋白酶蛋白酶K法1.配制新鮮溶液：25μl20mgml蛋白酶K；2.5ml1MTrisHCl（pH8.0）；0.5ml0.5MEDTA（pH8.0）；加水定容到加水定容到50ml。2.37℃下，將玻片放在架子上孵育5min（蛋白酶K不要預(yù)熱）。3.用PBS洗滌3次，每次5min。三、尿素法尿素法1.把玻片放在玻璃固定架上，再將架子放在盛有600ml的1M尿素（新鮮配制）的容器中

8、。2.微波10min，20min或者30min，每5min補(bǔ)充一次蒸發(fā)掉的水。3.冷卻30min到1h。4.用蒸餾水洗滌4次，每次3min再用PBS洗滌3min。免疫組化免疫組化SP法步驟法步驟1.烤片，68℃，20分鐘2.常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯I20min二甲苯II20min100%酒精I(xiàn)10min100%II10min95%5min80%5min70%5min3.阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O237℃孵育10mi

9、n，PBS沖洗3X5min；4.抗原修復(fù):置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3X5min。5.正常羊血清工作液封閉，37℃10min，傾去勿洗.6.滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3X5min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照）；滴加生物素標(biāo)記二抗37℃孵育30minPBS沖洗3X5min7.滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵

10、白素工作液，37℃孵育30minPBS沖洗3X5min8.DABH2O2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。SP法1）脫蠟、水化；2）PBS洗2～3次各5分鐘；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；4）PBS洗2～3次各5分鐘；5）抗原修復(fù)；6）PBS洗2～3次各5分鐘；7）滴加正常山羊血清封閉液室溫20分鐘。甩去多余液體。8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時(shí)或者4℃過夜或者37