1、青蒿素生物合成青蒿素生物合成10生物技術(shù)（2）班曾慶輝201024112211青蒿素是我國(guó)科研人員從傳統(tǒng)中醫(yī)藥黃花蒿中提取出來(lái)并自主研發(fā)的一種抗瘧疾特效藥[1][1]。20世紀(jì)70年代，我國(guó)科技工作者從黃花蒿中分離提純出一種抗瘧活性單體——青蒿素，以后又確定了它的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型。1986年我國(guó)自主研發(fā)的蒿甲醚油針劑、青蒿琥酯鈉鹽的水針劑以及青蒿素栓劑等抗瘧疾藥作為一類新藥在我國(guó)批準(zhǔn)生產(chǎn)。1995年蒿甲醚率先被收入國(guó)際藥典，這是我國(guó)首次得

2、到國(guó)際認(rèn)可的自主研發(fā)新藥。目前，青蒿素系列抗瘧藥已有5種新藥(青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、雙氫青蒿素、復(fù)方蒿甲醚)共9種劑型上市并在世界各國(guó)銷售，每年挽救了數(shù)百萬(wàn)重癥瘧疾患者的生命。除了獨(dú)特的抗瘧作用外，青蒿素系列藥物還具有抗血吸蟲、肺吸蟲、紅斑狼瘡、皮炎以及免疫調(diào)節(jié)，抗流感等多種療效[2][2]。但是，目前國(guó)際抗瘧藥市場(chǎng)上青蒿素類藥物只占有很少的份額，其原因主要在于青蒿素原料缺乏。由此，有研究者另辟蹊徑，設(shè)想通過(guò)生物合成青蒿素。時(shí)至今日

3、，青蒿素的生物合成已經(jīng)取得一定進(jìn)展，介紹如下：早在20世紀(jì)80年代，中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所汪猷院士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組就利用放射性同位素標(biāo)記的214C青蒿酸與青蒿勻漿(無(wú)細(xì)胞系統(tǒng))保溫法證明，青蒿酸和青蒿B是青蒿素的共同前體[3][3]。青蒿素生物合成途徑僅見(jiàn)于青蒿，但其“上游”途徑為真核生物所共有，可望通過(guò)“下游”途徑重建，在真核微生物(如酵母)中全合成青蒿素。過(guò)去10年來(lái)，青蒿素合成基因被國(guó)內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)陸續(xù)克隆并導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞，已

4、成功合成青蒿酸及雙氫青蒿酸等青蒿素前體。由于酵母缺乏適宜的細(xì)胞環(huán)境，尚不能將青蒿素前體轉(zhuǎn)變成青蒿素。因此，青蒿依然是青蒿素的唯一來(lái)源，凸顯出繼續(xù)開展青蒿種質(zhì)遺傳改良的必要性。同時(shí)，青蒿素生物合成的限速步驟尤其是終端反應(yīng)機(jī)制已基本得到闡明，有助于開展青蒿素形成與積累的環(huán)境模擬及仿生，從而為徹底緩解青蒿素的供求矛盾創(chuàng)造先機(jī)[4][4]。若以雙氫青蒿酸為青蒿素的直接前體，則青蒿素生物合成過(guò)程如下：首先是從乙酰輔酶A經(jīng)異戊烯基焦磷酸(IPP)、

5、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、法呢基焦磷酸到紫穗槐411二烯的合成途徑，其中DMAPP與IPP受IPP異構(gòu)酶(IPPI)催化發(fā)生互變，二者再被法呢基焦磷酸合成酶(FDS)作用生成法呢基焦磷酸，并在紫穗槐二烯合酶(ADS)催化下閉環(huán)產(chǎn)生紫穗槐411二烯；其次是從紫穗槐411二烯到雙氫青蒿酸的合成途徑，紫穗槐411二烯在細(xì)胞色素P450單加氧酶(CYP71AV1)催化下，經(jīng)連續(xù)氧化依次生成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸，其中青蒿醛受青蒿醛雙鍵還

6、原酶2(DBR2)催化而還原成雙氫青蒿醛，后者再在青蒿醛脫氫酶1(ALDH1)催化下氧化成雙氫青蒿酸。雙氫青蒿醇轉(zhuǎn)變成雙氫青蒿醛由ALDH1CYP71AV1催化，其逆反應(yīng)則由雙氫青蒿酸還原酶1(RED1)催化，最后是從雙氫青蒿酸到青蒿素的合成途徑，雙氫青蒿酸經(jīng)過(guò)未知的多個(gè)非酶促反應(yīng)最終生成青蒿素。此外，青蒿酸可能經(jīng)多步反應(yīng)合成青蒿素B后再轉(zhuǎn)變成青蒿素[5][5]。青蒿素的生物合成主要任務(wù)有：①青蒿素前體合成工程菌的構(gòu)建。在這里為了便于敘

7、述，將上述青蒿素生物合成過(guò)程分為“上游”、“中游”和“下游”三個(gè)途徑，分別是從乙酰輔酶A到法呢基焦磷酸的“上游”途徑、從法呢基焦磷酸到雙氫青蒿酸的“中游”途徑和從雙氫青蒿酸到青蒿素的“下游”途徑。到更好的效果。一種更有前景的創(chuàng)意是將青蒿中更多的非青蒿素合成途徑剔除或者僅保留青蒿素合成途徑及其他必要的代謝途徑，從而通過(guò)合成生物學(xué)創(chuàng)造出自然界不存在的新型代謝網(wǎng)絡(luò)。③通過(guò)調(diào)節(jié)激素及發(fā)育基因表達(dá)促進(jìn)青蒿素合成。細(xì)胞分裂素可刺激葉片生長(zhǎng)，而青蒿素

8、主要由青蒿葉片合成。因此，提高青蒿中的細(xì)胞分裂素水平有可能促進(jìn)青蒿素的合成。葉和春小組曾將異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(ipt)導(dǎo)入青蒿，結(jié)果使細(xì)胞分裂素水平提高2~3倍，青蒿素含量增加30%~70%。④利用異種植物創(chuàng)建青蒿素生物合成新支路。美國(guó)肯塔基大學(xué)的Chapel小組將青蒿ADS基因及鳥類FPS基因?qū)霟煵葜斜磉_(dá)，經(jīng)葉綠體信號(hào)序列引導(dǎo)，ADS和FPS被轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體，并合成紫穗槐411二烯，產(chǎn)量達(dá)到25μgg鮮重，如果將來(lái)能將青蒿素合成途徑“

9、搬到”葉綠體內(nèi)，那么這種獨(dú)特的“葉綠體催化”方法可能比常規(guī)的“細(xì)胞質(zhì)催化”方法更能獲得高產(chǎn)青蒿素。荷蘭Bouwmeester小組利用煙草表達(dá)青蒿ADS，F(xiàn)PS和HMGR基因，獲得產(chǎn)紫穗槐411二烯的轉(zhuǎn)基因煙草。但是，當(dāng)繼續(xù)導(dǎo)入CYP71AV1基因后，卻未檢測(cè)到預(yù)期產(chǎn)物青蒿酸，而只檢測(cè)到青蒿酸12β雙葡萄糖苷，產(chǎn)量達(dá)到39.5mgkg鮮重，推測(cè)其為煙草葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的催化產(chǎn)物。加拿大Covello小組將青蒿ADS和CYP71AV1基因?qū)?/p>

10、煙草后，只檢出紫穗槐411二烯和青蒿醇，未檢出青蒿酸。若再導(dǎo)入DBR2和ALDH1基因，也只檢出雙氫青蒿醇，未檢出雙氫青蒿酸。由此可見(jiàn)，盡管在青蒿以外的植物中重建青蒿素合成途徑是可行的，但在產(chǎn)物(如青蒿酸糖苷)的后處理上可能會(huì)面臨較多的技術(shù)困難。在青蒿素的生物合成過(guò)程還有幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題需要注意：①青蒿素合成基因表達(dá)具有時(shí)空特異性，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)追蹤分析了青蒿素合成基因的發(fā)育及組織表達(dá)模式，結(jié)果顯示，各基因的表達(dá)水平在8月份開花

11、前達(dá)到高峰，其中青蒿素特異合成ADSmRNA和CYP71AV1mRNA升幅最大，為最低水平的12和15倍。處于盛花期的青蒿在根、莖、葉、花各個(gè)組織中都能檢測(cè)到青蒿素合成基因的表達(dá)，葉片中ADSmRNA水平較其他組織高2倍左右。我們采用組織化學(xué)染色法和分光光度法對(duì)CYP71AV1啟動(dòng)子GUS融合基因轉(zhuǎn)化煙草在正常和脅迫條件下的表達(dá)進(jìn)行定性及定量檢測(cè)，結(jié)果表明：在脫水、4℃和紫外輻射條件下，轉(zhuǎn)基因煙草的GUS活性提高1.4~2.7倍。瑞典及

12、荷蘭科學(xué)家的研究結(jié)果表明，ADS，CYP71AV1，DBR2和ALDH1等青蒿素合成基因在花芽及嫩葉中的表達(dá)水平比其他組織(老葉、莖、根、發(fā)根培養(yǎng)細(xì)胞)高40~500倍，而對(duì)青蒿素合成有負(fù)調(diào)節(jié)作用的雙氫青蒿醛還原酶基因(RED1)則只在發(fā)根培養(yǎng)細(xì)胞中高表達(dá)。②內(nèi)外環(huán)境因素促進(jìn)青蒿素的合成與積累。早在2000年，葉和春小組就證明，植物病原真菌可以不同程度地促進(jìn)體外培養(yǎng)青蒿發(fā)根中青蒿素的積累，其中大麗花輪枝孢處理發(fā)根后的青蒿素含量比對(duì)照提高