1、FISH技術(shù)在血液腫瘤中的應(yīng)用,2,FISH-目前新興的分子遺傳學(xué)技術(shù)，原理是采用熒光標(biāo)記的DNA探針，利用探針與檢測樣本中DNA堿基對的互補性，在探針與標(biāo)本的DNA雜交后，通過熒光顯微鏡檢測熒光信號而得出結(jié)果，從而檢測細(xì)胞、組織樣本中的染色體和基因異常。,熒光原位雜交Fluorescence In Situ Hybridization, FISH,3,FISH基本實驗過程,4,FISH探針種類,根據(jù)標(biāo)記顏色的不同，常用探針主要有：

2、單色探針（single color probe, SC）雙色探針（dual color probe, DC）三色探針（triple color probe, TC）雙色分離探針（ dual color, break apart probe, DC, BCR）雙色單融合探針（ dual color, single fusion probe, DC, SF Trans）額外信號探針（extra signal, ES）雙色雙融合探

3、針（ dual color, dual fusion probe, DC, DF Trans）,5,,單色探針（SC）：雙色探針（DC）：三色探針（ TC）：,D7S486,CEP7,CEP18,Y,X,正常,正常,正常,異常,異常,異常,6,FISH技術(shù)的應(yīng)用,FISH檢測在臨床上主要應(yīng)用于：血液系統(tǒng)疾?。喊籽　DS、MM等；實體瘤：乳腺癌、膀胱癌等；產(chǎn)前遺傳篩查：唐氏綜合癥（21三體）等臨床意義：

4、從遺傳學(xué)角度檢測染色體和基因的異常輔助診斷，判斷預(yù)后，療效檢測及微小殘留檢測,7,FISH技術(shù)在血液腫瘤中的應(yīng)用,血液系統(tǒng)腫瘤是我國十大高發(fā)腫瘤之一。大量研究表明，不同類型的血液腫瘤往往有其特異的染色體異常，對腫瘤分型、診斷、治療和預(yù)測用預(yù)后都具有重要意義。常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析（CC）方法只能分析中期染色體，而對間期細(xì)胞、復(fù)雜核型細(xì)胞和染色體微缺失無法進(jìn)行診斷。FISH技術(shù)彌補了CC在這方面的不足，因此被廣泛應(yīng)用于血液腫瘤的研究、診斷等

5、方面。,白血病的細(xì)胞遺傳學(xué)異常,8,血液腫瘤的FISH檢測,臨床上對血液腫瘤的FISH檢測主要集中在以下幾個方面：染色體易位形成的融合基因檢測：如CML的BCR-ABL、M3的PML-RARA、M2b的AML1-ETO融合基因等；基因缺失檢測：如CLL的P53基因缺失提示患者預(yù)后很差，而13q單一缺失則提示預(yù)后較好；對異性間造血干細(xì)胞移植的植入狀態(tài)檢測：通過性染色體計數(shù)探針動態(tài)監(jiān)測供/受者混合性嵌合體比例變化對異性間異基因造血干細(xì)

6、胞移植后植入狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測；微小殘留病灶（MRD）的檢測：通過對腫瘤細(xì)胞特異的染色體異常進(jìn)行跟蹤監(jiān)測，預(yù)測疾病進(jìn)展和有無復(fù)發(fā)跡象。,9,血液腫瘤熒光原位雜交探針,10,多發(fā)性骨髓瘤（MM）檢測,MM常涉及多種染色體異常，主要為數(shù)目異常，分為超二倍體（+3、+5、+7、+9等）和非超二倍體（-8、-13、-14、-17等）；染色體結(jié)構(gòu)異常較少見，主要有1號（1p、1q，部分缺失或1q三體）、13q-、14q（多為與14q32有關(guān)的幾種互補

7、易位）等。MM FISH檢測位點：P53、RB1、D13S319、IGH基因及1q21位點。推薦樣本：骨髓適用人群：已確診為MM，需評估預(yù)后、進(jìn)行個體化治療的患者,11,,以p53探針模式圖為例，17號染色體1區(qū)3帶1亞帶包含p53的區(qū)域標(biāo)記了一段含綠色熒光的260kb DNA序列；D13S319指13號染色體上獨一無二的編號319的DNA片段，標(biāo)記了一段含紅色熒光的220kb DNA序列。正常情況下顯示2R2G信號，發(fā)生D

8、13S319位點缺失時顯示1R2G。IGH的探針在基因的兩端分別標(biāo)記了紅色和綠色熒光，正常情況下顯示紅色綠色重疊信號或黃色信號，當(dāng)IGH發(fā)生易位時顯示為紅色和綠色的分離熒光信號。,12,臨床意義,判斷生存期預(yù)后較差：P53缺失（24.7個月） 1q21 擴增（21.9個月） IGH發(fā)生t(4;14)，t(14;16)易位（24.7個月） 預(yù)后中等

9、（42.3個月）：RB1缺失 D13S319缺失 預(yù)后較好（50.5個月）：IGH發(fā)生t(11；14)易位或者其他遺傳改變指導(dǎo)臨床用藥（個體化治療）：MM的初治治療多選用化療，包括MP方案（馬法蘭、潑尼松）、VAD方案（長春新堿、多柔比星、地塞米松）等；對于難治和復(fù)發(fā)的多發(fā)性骨髓瘤，多采用聯(lián)合化療和沙利度胺進(jìn)行治療；干擾素主要用于維持治療，對上

10、述治療方法無效者可進(jìn)行造血干細(xì)胞移植。對于預(yù)后好的患者，使用α干擾素、環(huán)磷酰胺或聯(lián)合化療沒有明顯的區(qū)別；對于預(yù)后中等的患者，使用α干擾素治療反而會縮短患者總生存期?？梢姡喟l(fā)性骨髓瘤基因異常的檢測對臨床有效開展個性化治療提供了重要依據(jù)。,13,白血病FISH檢測,1、 慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）檢測檢測位點： P53、RB1、D13S25、ATM基因以及12號染色體。推薦樣本：外周血臨床意義：判斷生存期：預(yù)后差，P53缺失

11、（32個月） 預(yù)后較差， ATM缺失（79個月） 預(yù)后中等， CSP 12三體（114個月） 預(yù)后較好，RB1缺失、 D13S25缺失（133個月）指導(dǎo)臨床用藥（個體化治療）7-11%CLL伴有P53缺失，預(yù)后不良，漂吟類似物治療無效，

12、應(yīng)選用不涉及p53信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的藥物；ATM位于染色體11q22-23，11q22.3缺失是CLL另外一個預(yù)后較差的核型異常，發(fā)生率12-20%，ATM缺失與CLL進(jìn)展密切相關(guān)；+12是最早發(fā)現(xiàn)的B-CLL常見染色體異常，發(fā)生率15-35%，常伴有其他核型異常；13q缺失是CLL最常見的染色體異常，40-60%的CLL出現(xiàn)該異常。RB1和D13S25位于此位點，單純del(13q14)預(yù)后較好，若伴有+12、11q-等其他染色體異

13、常，則預(yù)后通常較差。,14,,2、 慢性粒細(xì)胞白血病（CML）檢測檢測位點： BCR/ABL融合基因、ASS基因。推薦樣本：骨髓適用人群：CML初診及治療監(jiān)測的患者,慢性粒細(xì)胞性白血病是一種發(fā)生在早期多能造血干細(xì)胞上的惡性骨髓增生性疾病（獲得性造血干細(xì)胞惡性克隆性疾?。?。對CML的檢測主要針對BCR/ABL融合基因，這種融合基因是通過（9；22）號染色體的基因重排及易位而形成的。,15,,BCR/ABL融合基因檢測BCR/

14、ABL融合基因通過t(9;22)號染色體易位而形成。9號染色體上原癌基因(ABL)的斷裂點比較恒定，22號上斷裂點簇集區(qū)(BCR)的斷裂點不恒定。BCR-ABL-210見于95％的CML(主要斷裂點斷裂形成)，BCR-ABL-190見于17%-30%的成人急性淋巴細(xì)胞白血病和2%-6%的兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(次要斷裂點斷裂形成)，但從染色體組型與慢性粒細(xì)胞白血病的費城染色體在形態(tài)上看不出區(qū)別，F(xiàn)ISH檢測BCR/ABL融合基因可以區(qū)

15、分。檢測探針：額外信號探針（ES ）：可區(qū)分BCR/ABL融合基因形成于主要斷裂點（M-BCR位點）或次要斷裂點（m-BCR位點） 。雙色雙融合探針（DF） ：只可檢測是否有BCR/ABL融合基因，不能區(qū)分主次斷裂點。,16,,1. ES探針 可區(qū)分BCR/ABL融合基因形成于主要斷裂點或次要斷裂點，用于初診和指導(dǎo)格列衛(wèi)用藥。異常結(jié)果顯示為兩紅、一綠、一黃熒光信號。,在典型的陽性細(xì)胞中，如果有BCR/ABL融合基因且

16、BCR斷裂位點為M-BCR，其信號類型體現(xiàn)為2R1G1F；斷裂位點為m-BCR，其信號類型體現(xiàn)為1R1G2F（其中一個融合信號中的綠點相對較?。?；無BCR/ABL融合基因，其信號類型體現(xiàn)為2R2G。,17,,2. DF探針 只可檢測是否有BCR/ABL融合基因，不能區(qū)分主、次斷裂點，可用于治療效果監(jiān)測及用藥指導(dǎo)。異常結(jié)果顯示為一紅、一綠、兩黃熒光信號。,18,,BCR/ABL融合基因檢測意義輔助診斷CML NCC

17、N腫瘤學(xué)臨床實踐指南（2010年第二版）指出，BCR/ABL融合基因陰性的患者不是CML。這些患者的預(yù)后比BCR/ABL融合基因陽性的患者明顯差。因此，對于BCR/ABL融合基因陰性的患者需要進(jìn)一步考慮其他疾病。指導(dǎo)格列衛(wèi)使用 格列衛(wèi)是在研究出CML患者高表達(dá)BCR/ABL融合基因蛋白產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研發(fā)出的特異性抑制BCR/ABL融合基因產(chǎn)物的分子靶向藥物。采用FISH技術(shù)對CML患者BCR/ABL融合基因進(jìn)行檢測，一

18、旦確定了BCR/ABL融合基因的存在，就可以考慮使用格列衛(wèi)進(jìn)行治療。藥物使用效果評估骨髓移植效果評估鑒別診斷：鑒別CML急變和AL BCR/ABL融合基因檢測顯示，AL的BCR/ABL融合基因由次要斷裂點斷裂形成，CML急變患者的BCR/ABL融合基因由主要斷裂點斷裂形成。檢測BCR/ABL融合基因，區(qū)別其主要斷裂點和次要斷裂點，達(dá)到鑒別診斷的目的。,19,,ASS基因異常檢測 ASS為精氨基琥珀酸合成

19、基因,位于9q34.1。ASS基因檢測意義：評估CML患者預(yù)后 9-28％CML患者伴有含ASS基因的9q34區(qū)段的缺失，此種患者預(yù)后差，慢性期易急變。,20,,3、急性原始粒細(xì)胞白血病部分分化型（M2）檢測檢測位點： AML1/ETO融合基因。推薦樣本：骨髓,AML1/ETO融合基因：競爭性抑制AML1靶基因的活化，干擾細(xì)胞正常的增殖與分化。,AML1,ETO,21,,AML1/ETO融合基因檢測意義輔助

20、診斷M2型AML AML1/ETO融合基因可見于92%的M2型AML患者中，特別是和我國首先提出的M2b型密切相關(guān)。判斷預(yù)后 AML1/ETO融合基因陽性是預(yù)后好的標(biāo)志，患者對治療反應(yīng)佳，完全緩解率可達(dá)90%，5年無病生存可達(dá)50%-70%。,22,,4、急性早幼粒細(xì)胞白血病（M3）檢測檢測位點：PML/RARA融合基因。推薦樣本：骨髓,PML基因：早幼粒細(xì)胞白血病基因，位于15號染色體上。,RARA基因：維

21、甲酸受體基因，位于17號染色體上。,15號染色體和17號染色體發(fā)生特異位點的斷裂易位，形成PML/RARA融合基因，此融合基因可以抑制正常的RAR?基因功能，從而阻斷早幼粒細(xì)胞的進(jìn)一步分化成熟，產(chǎn)生大量幼稚的早幼粒細(xì)胞，發(fā)生腫瘤。,23,,PML/RARA融合基因檢測意義輔助診斷急性早幼粒細(xì)胞白血病 PML/RARA融合基因可見于90％以上的APL中，成為APL的一個特異標(biāo)志。指導(dǎo)全反式維甲酸（All trans-ret

22、inoic acid，ATRA）用藥ATRA治療APL的主要機制是靶向降解PML/RARA融合蛋白，促進(jìn)阻滯在早幼粒細(xì)胞階段的白血病細(xì)胞分化成熟。ATRA是治療APL的首選藥物,緩解率能達(dá)90% 。,24,,5、粒-單核細(xì)胞白血病檢測檢測位點： CBFB基因斷裂重組。推薦樣本：骨髓,CBFB基因（Core binding factor β，CBFB）：核心結(jié)合因子 ,位于16號染色體上。,CBFB也是早期造血所必需的轉(zhuǎn)錄因子，通

23、過與AML1的Runt同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合，由AML1將其帶至胞核，增強AML1與DNA的結(jié)合能力，使AML1依賴的基因轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。,25,,CBFB基因斷裂重組檢測意義輔助診斷M4型AML CBFB基因斷裂重組是AML的特征性染色體異常，占總AML患者的5%-10%和23％的M4患者，通常見于AML-M4E0亞型?，F(xiàn)在認(rèn)為CBFB基因斷裂重組是M4E0特征性的遺傳學(xué)改變。評估預(yù)后 CBFB基因斷裂重組的AML患者

24、對化療敏感、預(yù)后較好。,26,,6、小兒急性淋巴細(xì)胞白血病檢測急性淋巴細(xì)胞白血病是兒童中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，我國l5歲以下小兒白血病的發(fā)病率為2.73/10萬。兒童急性淋巴細(xì)胞白血病在兒童白血病中占75%之多，是兒童白血病中最常見的類型。探針介紹：,27,,4、10、17號染色體檢測兒童ALL約25%有染色體數(shù)目增加，以4、10、17號染色體受累較為多見。4、10和17染色體三體是獨立的預(yù)后良好的指標(biāo)，這類患者7年EFS大于

25、90%。TEL/AML1融合基因檢測TEL/AML1在兒童ALL中的發(fā)生率高達(dá)20％-25％，是目前兒童ALL最常見的染色體重排。但由于t(12;21)十分微小，不易被常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)。大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)TEL/AML1陽性的兒童ALL治療效果很好，5年EFS和總生存率達(dá)到89％和97％，是預(yù)后良好的指標(biāo)之一。MLL基因斷裂重組檢測MLL基因改變在急性白血病中的發(fā)生率約為5％～10％，在嬰兒ALL中則高達(dá)79％，是預(yù)后不良的標(biāo)志

26、。BCR/ABL融合基因檢測BCR/ABL融合基因占兒童ALL的3％～5％，是最重要的預(yù)后不良因素之一。一旦檢測出BCR/ABL融合基因，患兒需接受更為強烈的化療或造血干細(xì)胞移植。但大多數(shù)患兒仍會治療失敗，5年EFS只有28.6％。,28,,臨床意義預(yù)后評估TEL/AML1基因融合或4、10、17號染色體三體的患者預(yù)后較好；MLL基因重排的患者預(yù)后較差；BCR/ABL基因融合的患者預(yù)后非常差。,美國兒童腫瘤組（Childre

27、n oncology group, COG）根據(jù)發(fā)病年齡、初診白細(xì)胞數(shù)、染色體和融合基因、初診時CNS或睪丸白血病以及誘導(dǎo)化療的骨髓原始幼稚細(xì)胞比例或MRD水平，將兒童ALL分為低危[t(12;21)/TEL-AML1或4、10、17號染色體三體]、標(biāo)危、高危（MLL重排）和高高危[t(9；22)/BCR-ABL]4組。,29,骨髓增生異常綜合征FISH檢測,骨髓增生異常綜合征（MDS）是一組起源于造血干細(xì)胞，以血細(xì)胞病態(tài)造血、高風(fēng)險向

28、急性白血病轉(zhuǎn)化為特征的難治性血細(xì)胞質(zhì)、量異常的異質(zhì)性疾病。發(fā)病率：3/10萬 分類：難治性貧血（RA） 難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞（RARS） 難治性血細(xì)胞減少伴多系發(fā)育異常（RCMD） 難治性貧血伴原始細(xì)胞增多（RAEB） 骨髓增生異常綜合征，無法分類（MDS，U） 5q-

29、綜合征（MDS，5q-）,30,臨床癥狀及轉(zhuǎn)歸,20%的MDS患者死于感染,,31,MDS 染色體核型預(yù)后分組,,32,,MDS染色體及基因異常FISH檢測探針,適用人群：臨床經(jīng)常規(guī)檢測排除常見原因?qū)е碌呢氀?，需?jīng)骨穿進(jìn)一步診斷的患者。需借助細(xì)胞遺傳學(xué)異常確診的可疑MDS患者臨床已經(jīng)診斷為MDS，需結(jié)合遺傳學(xué)異常判斷預(yù)后的患者。,33,,臨床意義鑒別診斷染色體異常是MDS與其他非克隆性血液系統(tǒng)疾病所致貧血如再生障礙性貧血、缺鐵

30、性貧血、巨幼細(xì)胞貧血等鑒別診斷的主要依據(jù)之一。 輔助診斷MDSMDS患者存在的克隆性染色體異常多為缺失性改變， 40%-70%的MDS患者可有細(xì)胞遺傳學(xué)異常，以-5/5q-、-7/7q-、+8、20q-最為常見。染色體異常是MDS維也納診斷標(biāo)準(zhǔn)的三大確定標(biāo)準(zhǔn)之一。根據(jù)建議，MDS診斷滿足兩個必要標(biāo)準(zhǔn)和一個確定標(biāo)準(zhǔn)即可。預(yù)后評估，指導(dǎo)臨床個體化治療正常核型、5q-、20q-、-Y的MDS患者預(yù)后較好；-7/7q-、復(fù)雜異常的M

31、DS患者預(yù)后差；低危組MDS采用促進(jìn)造血、誘導(dǎo)分化和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑;高危組MDS采用AML的聯(lián)合化療方案和造血干細(xì)胞移植。,34,性染色體檢測,用于監(jiān)測異性異基因造血干細(xì)胞移植效果,男性患者骨髓移植前 男性患者骨髓移植后,探針：CSP X/CSP Y,35,淋巴瘤FISH檢測,36,FISH檢測結(jié)果統(tǒng)計,FISH-MDS,在113例MDS確診病例中，F(xiàn)ISH檢測發(fā)現(xiàn)26例存在染色體異常改變,37,,MDS（F

32、ISH）檢測報告單 姓名： 年齡： 性別： 病例號： 申請單號： 科別： 標(biāo)本種類： 臨床診斷： 送檢時間：,CSFIR/D5S23探針 EGR1/D5S23探針

33、 D7S486/CSP7探針（5q33紅/5p綠） (5q31紅/5p綠) （7q31紅/CSP7綠）,D7S522/CSP7探針 X/Y探針 D20S108/CSP8探針（7q31紅/CSP7綠）

34、 （X綠/Y紅） （20q12紅/CSP8綠）,結(jié)果分析：本次試驗分別計數(shù)200個細(xì)胞，各異常細(xì)胞百分比分別為：GLP CSFIR探針： 50%，GLP D5S23探針：0%；GLP EGR1探針： 50%，GLP D5S23探針：0%；GLP D7S486探針：0 %，CSP 7探針：0%；GLP D7S522探針：0%，CSP 7探針：0 %；GL

35、P D20S108探針：0 %，CSP8探針：0%；CSP X：0%，CSP Y：0%。實驗診斷提示:46，XX,5q-， 請結(jié)合其它檢測結(jié)果和臨床癥狀綜合判斷。,38,FISH檢測結(jié)果統(tǒng)計,FISH-CML (BCR/ABL ),FISH-IGH,39,,BCR/ABL（FISH）檢測報告 IGH基因（FISH）檢測報告,結(jié)果分析：本次試驗分別計數(shù)200個細(xì)胞，異常細(xì)胞百分比為90%。檢測值閾值(5.0%)，判定為陽性

36、結(jié)果。實驗診斷提示：該標(biāo)本檢測到BCR/ABL基因融合比例為90%（主要斷裂點），請結(jié)合其它檢測結(jié)果和臨床癥狀綜合判斷。,正常信號模式：2紅2綠異常信號模式：1黃1綠1紅,BCR/ABL-210融合基因,BCR/ABL (ES)(BCR 綠/ABL紅),信號模式,檢測靶基因,探針名稱,,,,,,,,結(jié)果分析：本次試驗計數(shù)200個細(xì)胞，各信號模式細(xì)胞百分比分別如下：2黃：87%；1黃1綠1紅（典型異常信號）：13.0%。實驗診斷提

37、示：檢測到該標(biāo)本IGH基因斷裂重組，請結(jié)合其它檢測結(jié)果和臨床癥狀綜合判斷。,正常信號模式：2黃異常信號模式：1黃1綠1紅,IGH基因斷裂重組,GLP IGH,信號模式,檢測靶基因,探針名稱,,,,,,,,40,FISH檢測結(jié)果統(tǒng)計,FISH-MM,在19例MM患者中，F(xiàn)ISH檢測發(fā)現(xiàn)9例存在染色體異常改變,41,,MM（FISH）檢測報告單 姓名： 年齡： 性別：

38、 病例號： 申請單號： 科別： 標(biāo)本種類： 臨床診斷： 送檢時間：,結(jié)果分析：本次試驗分別計數(shù)200個細(xì)胞，各異常細(xì)胞百分比分別為： GLP 1q21：21.0%，GLP RB1：17.0%；GLP D13S319：2.0%，GLP P53：3.0%；GLP IGH

39、探針：1.0 %。各探針檢測閾值均為5%。實驗診斷提示:1q21擴增，RB1缺失， 請結(jié)合其它檢測結(jié)果和臨床癥狀綜合判斷。,1q21/RB1探針 IGH探針 P53/D13S319探針 （1q21紅/RB1綠） （D13S319紅/ P53綠）,42,,FISH是細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)