1、南京農(nóng)業(yè)大學博士學位論文雞骨保護素真核質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-chOPG的構(gòu)建及其在蛋雞體內(nèi)、外表達及功能的研究姓名：侯樂樂申請學位級別：博士專業(yè)：臨床獸醫(yī)學指導教師：侯加法201106雞骨保護素真核質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 ( + ) ．c h O P G 的構(gòu)建及其在蛋雞體內(nèi)、外表達和功能的研究而對照組和空載體組呈陰性，并且脂質(zhì)體和質(zhì)粒的比例為l ：3 時，效果最明顯。w r e s t e mB l o t 檢測表達的

2、c h 0 P G 蛋白的大小約為9 0 k D a ；E L I S A 檢測顯示c h O P G舍量在上清液中為1 5 ．7 8 士0 ．2 2n g ·m L ．1 。p c D N A 3 ．1 ( + ) ．c h 0 P G 質(zhì)粒能被轉(zhuǎn)染到雞胚成纖維細胞中，并表達c h 0 P G 蛋白。試驗I I I c h O P G 重組蛋白對體外培養(yǎng)雞胚破骨細胞凋亡、骨吸收功能的影晌研究真核重組質(zhì)粒p C D N A 3

3、 ．1 ( + ) ．c h O P G 轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞后表達的外源c h O P G 蛋白對破骨細胞凋亡、骨吸收功能的影響。機械分離雞胚破骨細胞，獲得破骨細胞懸液，隨機分為空白對照組、空載體組、p c D N A 3 ．1 ( + ) ．c h O P G 質(zhì)粒組。用流式細胞儀檢測破骨細胞凋亡結(jié)果；重氮鹽法檢測破骨細胞分泌的T R A P 活力；噬骨試驗檢測骨吸收陷窩的數(shù)量和面積以及測定鈣離子含量，觀察破骨細胞的骨吸收功能。與空白

4、組和空載體組相比，p c D N A 3 ．1 ( + ) ．c h O P G 質(zhì)粒組破骨細胞凋亡率顯著升高，而T R A P 酶濃度，骨吸收陷窩的數(shù)量、面積和鈣離子濃度，p c D N A 3 ．1 ( + ) ．c h O P G 質(zhì)粒組下降，差異極顯著( 尸< O ．0 1 ) ．真核重組質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 ( + ) 一c h O P G 轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞后表達的O P G 蛋白能抑制體外破骨細胞的生物學

5、活性，促進破骨細胞凋亡。試驗Ⅳc h O P G 外源蛋白的表達及其在不同組織中的分布研究c h O P G 外源蛋白的表達及其在不同組織的分布。3 6 羽5 6 周齡的I S A蛋雞隨機分為2 組( 1 2 羽對照，2 4 羽試驗) ．對照組和試驗組分別肌肉注射3 0 0p L 生理鹽水和3 0 0 鷴質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 ( + ) - c h O P G 。注射后3 h 、1d 、7 d 、1 4 d 、2 1d 、2

6、 8d 采集注射部位的肌肉、對側(cè)肌肉、肝、腎、脾及心臟。分別采用I m P c R和w e s t e mB l o t 的方法檢測其組織中c h 0 P G 基因蛋白表達及含量，P C R 法和組織切片技術(shù)用于檢測質(zhì)粒分布和組織病變．注射部位骨骼肌3h 后即檢測到c h O P G 蛋白的表達，7d 達到最高值，然后逐漸下降，2 8d 完全消失．1d 后所有組織均檢測到質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 ( + ) - c h o P

7、G ，以后則逐漸下降，2 8 d 后所有組織中均消失．質(zhì)粒在肝臟中代謝速度最快．主要器官即心、肝、脾、腎、注射部位骨骼肌組織未發(fā)現(xiàn)明顯的病理學變化．肌注3 0 0 鷴p c D N A 3 ．1 ( + ) 一c h O P G 質(zhì)粒后，c h 0 P G 外源蛋白及質(zhì)粒表達量在開始數(shù)天較高，以后逐漸下降，2 8 d 完全消失，主要器官組織未發(fā)現(xiàn)明顯的病理學異常．試驗V 質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 ( + ) - c h O P