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![中國對蝦(Penaeus chinensis)原肌球蛋白抗原表位和關鍵氨基酸的篩選及糖基化對其過敏原性的影響.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/6/23/54a50cdb-727e-4b99-ae64-6e6dde757a6b/54a50cdb-727e-4b99-ae64-6e6dde757a6b1.gif)
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文檔簡介
1、中國對蝦作為中國沿海區(qū)域主要的對蝦養(yǎng)殖品種,其味道鮮美、營養(yǎng)豐富,受到廣大消費者的喜愛。但由中國對蝦引起的過敏案列也日益增多,而現階段對其過敏性研究,仍處于起步階段。過敏影響人體健康,甚至危害生命,故探究對蝦過敏原致敏機制對過敏的預防和治療都有重要意義。在已鑒定中國對蝦主要過敏原為原肌球蛋白的基礎上,本文進一步深入研究,在氨基酸分子層面結合其結構探查其致敏機制,主要通過生物信息學方法預測原肌球蛋白的表位,多方法篩選抗原多肽,預測其關鍵氨
2、基酸并建立空間模型。在此基礎上,利用糖基化法消減蛋白和表位多肽的過敏原性。主要內容如下:
1、利用生物信息學軟件DNAstar和AntheProt,結合三種在線預測生物學網站,分析中國對蝦主要過敏原(原肌球蛋白)的氨基酸序列,綜合預測出12條潛在抗原表位并用Fmoc法固相合成。通過icELISA法和dot-blot法,借助30位對蝦過敏患者的特異性血清,篩選出10條與血清呈現高的親和力的表位多肽。
2、通過生物信息學
3、分析原肌球蛋白的氨基酸序列,借助SWISS-MODEL建模工具,篩選出模板野豬原肌球蛋白1c1g。用軟件PyMOL修改模板氨基酸序列,得到中國對蝦原肌球蛋白的空間構象模型,并用VMD軟件分析模板的拉式構象圖,結果顯示建模模板合理。從模型構象中可以看出,中國對蝦原肌球蛋白構象以α-螺旋的二級結構為主,沒有復雜的三級和四級結構。蛋白不具有形成構象表位的條件,多肽為線性表位且暴露在外側。本文利用軟件BioEdit分析蛋白質氨基酸和表位中氨基酸
4、的出現頻率,同時用軟件Vector NTI對比中國對蝦原肌球蛋白和SDAP數據庫中過敏食物原肌球蛋白的氨基酸序列,分析其保守性,綜合兩種方法分析得出潛在的表位關鍵氨基酸。以多肽T-03、T-07和T-12為例,將表位中潛在關鍵氨基酸突變?yōu)楸彼?,并進行固相合成。用icELISA法借助血清分析突變后多肽的過敏原活性變化,結果顯示突變肽T-03中的D、T-07中的D、E和T-12中的E,與抗體IgE結合程度明顯下降,說明這幾個氨基酸為各自表
5、位中的關鍵氨基酸。
3、利用核糖、低聚半乳糖、低聚殼聚糖對原肌球蛋白和抗原表位進行糖基化,可顯著消減其過敏原活性。而蛋白、抗原表位與麥芽糖糖基化后的產物則無明顯的免疫原活性變化。借助ELISA法、圓二色譜法及有效賴氨酸含量測定,對三種糖糖基化后產物進行檢測分析。結果顯示,在糖基化反應20 min-4 h時,蛋白糖基化產物與血清IgE的結合能力無明顯變化;8h-12 h時,糖基化產物與血清IgE的結合能力有所下降,說明過敏蛋白的
6、免疫原活性減弱??乖嚯脑?0min-2h時,過敏原性無明顯變化;4-12h時,多肽過敏原性減弱。二級結構分析顯示,原肌球蛋白核糖糖基化產物α-螺旋結構下降了13.79%,低聚半乳糖糖基化產物α-螺旋結構下降了10.47%,低聚殼聚糖糖基化產物α-螺旋結構下降了10.34%。多肽與低聚半乳糖、低聚殼聚糖糖基化產物,α-螺旋結構也呈現下降趨勢,核糖作用糖基化后產物則無規(guī)律性變化。原肌球蛋白的賴氨酸含量有明顯的下降趨勢,多肽的有效賴氨酸含量
7、則無明顯的變化規(guī)律。
4、利用血清IgE介導人源肥大細胞脫顆粒釋放模型,分析檢測原肌球蛋白和抗原表位的過敏原性??乖畹蜐舛? ug/mL時,肥大細胞進行脫顆粒。組胺、類胰蛋白酶和β-己糖胺酶是檢測肥大細胞脫顆粒的主要指標,其結果顯示有10條多肽為過敏原,同icELISA和dot-blot檢測結果一致,且以多肽T-03、T-07和T-12釋放量最多。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、細胞趨化因子(IL-1β、IL-
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