1、蛋白酶抑制劑是對蛋白酶有專一抑制作用的一類小分子化合物或多肽的總稱，普遍存在于植物、動物和微生物中。蛋白酶抑制劑具有維持機體內環(huán)境穩(wěn)定，抗HIV、抗蟲和抗真菌以及抑制腫瘤細胞增殖等活性。蕎麥胰蛋白酶抑制劑(BTI)來自蕎麥種子，屬于Potato I型蛋白酶抑制劑家族，由69個氨基酸組成，分子量為7.9 kDa。前期研究結果表明，重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑(rBTI)能抑制某些腫瘤細胞增殖，如EC9706、K562、Hep G2、Hela等，

2、而對正常肝細胞HL7702沒有影響。但rBTI抑制腫瘤細胞增殖的具體分子機制和靶點還不明確。本文以rBTI為材料，探究其對Hep G2細胞增殖抑制的可能分子機制。研究內容主要圍繞三個方面開展：
　　1.采用MTT法和流式細胞術分別檢測了rBTI對Hep G2細胞增殖以及細胞周期的影響，免疫熒光及Western印跡法檢測了PTEN和p-PTEN的亞細胞定位及蛋白表達的變化，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)及Western印跡

3、法檢測了周期相關蛋白的表達，旨在探究PTEN和p-PTEN在rBTI抑制Hep G2細胞增殖和周期阻滯中的作用。結果表明，rBTI能顯著抑制Hep G2細胞增殖，將細胞周期阻滯在G0/G1期，并呈時間和劑量依賴性；rBTI作用于Hep G2細胞后，可顯著上調PTEN和p-PTEN的表達，同時發(fā)現(xiàn)過表達的p-PTEN分布于細胞核中，能與核仁共定位；周期相關蛋白檢測表明，細胞內p53、p21轉錄水平和蛋白水平均增加。由此說明，rBTI通過上

4、調PTEN表達，使得細胞周期阻滯于G0/G1期，進而抑制Hep G2細胞增殖。
　　2.采用qRT-PCR法檢測rBTI對PTEN基因表達的影響，采用流式細胞術和熒光顯微鏡觀察細胞內ROS的變化情況，通過Western blot法檢測rBTI和rBTI聯(lián)合ROS清除劑NAC作用于Hep G2細胞后，細胞中PTEN、p-PTEN的變化情況，旨在探究PTEN變化情況與細胞內ROS之間的關系。結果表明，rBTI作用于細胞后，PTEN基因

5、表達和ROS生成增加；Western blot結果表明，rBTI使細胞中PTEN和p-PTEN表達上調；而當用NAC作用Hep G2細胞后，細胞內ROS水平有所下調，同時細胞內PTEN和p-PTEN的表達也隨之下調。因此，我們得出結論，細胞內PTEN表達升高由rBTI誘導的ROS所介導。
　　3.采用MTT法檢測rBTI和自噬抑制劑3-MA對Hep G2細胞增殖的影響，通過質粒轉染和Western blot檢測rBTI以及rBTI

6、聯(lián)合磷酸酶抑制劑phen對EGFP-LC3分布以及自噬相關蛋白LC3和p62表達的影響，通過Western blot檢測rBTI以及rBTI
　　聯(lián)合phen對PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響。結果表明，rBTI抑制Hep G2細胞增殖是通過自噬誘發(fā)的；當rBTI作用于已轉染pEGFP-LC3質粒的Hep G2細胞后，細胞中EGFP-LC3蛋白表達上調，并且LC3的聚集狀態(tài)發(fā)生明顯變化，胞質中的LC3以點狀形式

7、存在；Western blot結果表明，rBTI作用于Hep G2細胞后，細胞內LC3 II/I比值升高、自噬底物p62表達降低，同時發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白p-AKT和p-mTOR表達降低；與rBTI單獨處理組相比，rBTI和phen聯(lián)合作用于細胞后，細胞中EGFP-LC3蛋白表達有所下調，Western blot結果中LC3 II/I比值下調、自噬底物p62表達有所升高，并且發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號通

8、路相關蛋白p-AKT、p-mTOR表達有所恢復。因此，推測rBTI通過上調PTEN的表達，抑制PI3K/AKT通路，從而誘導Hep G2細胞發(fā)生自噬。
　　綜上所述，rBTI作用于Hep G2細胞后，使細胞周期阻滯于G0/G1期，進而抑制Hep G2細胞的增殖；rBTI刺激細胞內ROS產(chǎn)生；升高的ROS上調抑癌蛋白PTEN表達，進而影響PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導細胞發(fā)生自噬。這些研究內容為從分子水平上了解該類蛋白質抑制