1、生物素AP-tag技術是指在目的蛋白的N端或C端加上由15個氨基酸（GLND IFEAQKIEWHE)組成的受體肽（acceptor peptide，AP)小標簽，該小標簽可被生物素連接酶BirA特異性識別，B irA酶可催化生物素轉移到靶標蛋白標簽上的賴氨酸殘基上，導致帶有標簽的靶標蛋白在體內或體外都能被生物素化。該生物素化過程為酶促反應，反應條件相當溫和而且標記的專一性極高。生物素AP-tag技術具有高效、位點特異及操作方便等特點，

2、同時由于序列短小，對靶標蛋白的構象及活性影響極低。鏈霉親和素可以專一地與生物素結合，且兩者間的結合力是自然界已知的最強的非共價結合作用力，結合常數(shù)Kd值高達10-15mol/L，比抗原與抗體間的結合力高1萬倍。因此，可在嚴格的洗脫條件下分離出目標蛋白及其蛋白特異性相互作用的復合物。F0XM1是Forkheadbox轉錄因子家族的成員之一，它與細胞增殖、衰老、DNA損傷修復、再生和腫瘤等許多生理病理過程都有密切關系。
　　本研究構建

3、基于生物素AP-tag的F0XM1真核表達載體，利用生物素與鏈霉親和素的高特異性、高親和力的結合性質對F0XM1蛋白進行純化，為后續(xù)鑒定其互作分子的研究奠定基礎。分別構建真核表達載體pcDNA-AP-FOXMl和大腸桿菌生物素連接酶BirA真核表達載體pcDNA-BirA，將pcDNA-AP-FOXMl和pcDNA-BirA共轉染人胚腎293T細胞，使用鏈霉親和素瓊脂糖珠純化生物素標記的F0XM1，通過銀染及Western印跡檢測細胞裂

4、解液以及親和純化后的蛋白復合物，確定了相關蛋白表達情況。研宄發(fā)現(xiàn)AP-F0XM1在 HEK293T細胞中被生物素化且該蛋白在Western印跡、pull down等實驗中可實現(xiàn)無需抗體的一步法應用。另外，分別構建了的pcDNA-AP-FOXMl(l-224aa)和pcDNA-AP-FOXMl(l-353aa),在細胞內表達不同長度的可生物素化的F0XM1,并驗證了FOXM1的互作蛋白p-catenin與 F0XM1的C端發(fā)生互作，為研宄