1、魚類腸道中存在豐富的菌群，它們通過分泌酶類和產生活性物質參與宿主的生命活動，與機體的免疫和營養(yǎng)密切相關。本實驗采用高通量測序技術(high-throughput sequencing)中的454焦磷酸測序技術(454 pyrosequencing)分析分別攝食配合飼料或冰鮮魚的大黃魚（Pseudosciaena crocea）幼魚腸道壁和腸道內容物中的菌群;采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法篩選分離出大黃魚幼魚腸道內容物菌群，基于培養(yǎng)分離的幼魚腸道內容物的

2、菌株，采用Fusion primer and nested integratedPCR(FPNI-PCR)方法從檸檬酸桿菌P（Citrobacter sp.P）克隆出幾丁質酶基因chi-X，并在大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中表達，探討該酶的性質;測定假單胞菌X(Pseudomonas sp.X)分泌脂肪酶能力，采用FPNI-PCR克隆出脂肪酶基因lipase-X，構建大腸桿菌表達體系。得到結果和結論如下:

3、
　　 1.攝食不同食物的大黃魚幼魚腸道壁及其內容物菌群多樣性分析
　　 454焦磷酸測序結果表明，大黃魚幼魚腸道內容物及腸道壁中變形菌門(Proteobacteria)為主要優(yōu)勢菌，其次是梭桿菌門(Fusobacteria)及厚壁菌門(Firmicutes)。
　　 基于16S rRNA V3區(qū)454焦磷酸測序結果的聚類分析顯示:攝食配合飼料和冰鮮魚的大黃魚幼魚腸道內容物及其腸道壁中的菌群差異明顯。相同處理組的

4、大黃魚幼魚腸道內容物和腸道壁的菌群相似?；?6S rRNA V6區(qū)454焦磷酸測序結果的聚類分析顯示:攝食配合飼料大黃魚幼魚腸道內容物和腸道壁菌群較相似，攝食冰鮮魚幼魚腸道內容物與腸道壁菌群差異較大。主成分分析結果發(fā)現，食物種類是主要影響因子。
　　 2.攝食冰鮮魚的大黃魚幼魚腸道內容物菌群的培養(yǎng)分離
　　 采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法共鑒定出17種細菌及6種真菌，分別屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、檸檬酸桿菌屬（Citroba

5、cter）、腸桿菌屬（En tero ba cter）、寡單胞菌屬（Stenotrophomonas）、迪茨菌屬（Dietzia）、摩根氏菌屬（Morganella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢菌屬（Cladosporium）、紅酵母屬（Rhodotorula）、菌絨孢屬（Mycovellosiella）、青霉菌屬（Penicillium）及大單孢屬(Aplosporella)。

6、　　 3.大黃魚幼魚腸道內容物中檸檬酸桿菌P的幾丁質酶基因chi-X的克隆及表達
　　 采用FPNI-PCR從檸檬酸桿菌P克隆出幾丁質酶基因chi-X，在大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中成功表達，并測定該酶的性質。chi-X基因登錄號為GenBank KC290945。根據預測結果，chi-X編碼的氨基酸序列含493個殘基及幾丁質酶18家族催化域，與其他幾丁質酶基因相似性低于63％。重組蛋白CHI

7、-X經鎳柱層析后得以純化。以膠體幾丁質為底物時，純化蛋白CHI-X最適反應pH為4.0，pH3.0-8.0時其相對酶活大于60％;最適反應溫度為60℃;在pH3.0-11.0范圍內，溫度低于60℃時保存穩(wěn)定;其比活為137.65 U/mg蛋白;Km和Vmax值分別為6.24 mg/mL和2.49μtmol/min; Mn2+促進其酶活、Ag+抑制其酶活;具有抗蛋白酶性質;酶解產物為N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N，N'-二乙酰殼二

8、糖(GlcNAc2)。CHI-X能降解膠體幾丁質和蝦殼幾丁質。
　　 4.大黃魚幼魚腸道內容物中假單胞菌X產脂肪酶能力及脂肪酶基因的克隆
　　 采用對硝基苯酚法(pNP method)，以4-硝基苯基癸酯為底物，測定脂肪酶酶活。假單胞菌X在LB液體培養(yǎng)基中產胞外脂肪酶量為2.99 U/L。采用FPNI-PCR從假單胞菌X中克隆出脂肪酶基因lipase-X，并成功構建了其大腸桿菌表達體系，初步鑒定重組蛋白Lipase-X的