1、血漿脂蛋白（a）[LP(a)]是人類血漿中一個遺傳性質復雜的脂蛋白。LPA基因[包括Kringle IV拷貝數(shù)和單核苷酸多態(tài)性（SNP）]是決定LP（a）濃度變化的主要因素，對于動脈粥樣硬化（AS）和冠狀動脈心臟疾病（CDH）來說高脂蛋白（a）水平是其發(fā)生的獨立危險因子。但至今為止仍然缺少專一有效的方法來下調高 Lp(a)血癥患者血漿中的Lp(a)水平，目前臨床上也是缺乏高效安全降低血漿LP（a）水平的治療方法，但是經(jīng)過一系列研究發(fā)現(xiàn)通

2、過單采高風險患者降低高血漿LP（a）水平與最大限度地降低低密度脂蛋白膽固醇水平可以顯著降低冠脈事件的發(fā)生。載脂蛋白(a)[apo(a)]它是LP(a)的特異性抗原，大量的研究表明Lp(a)血漿濃度個體差異非常大，并因為apo(a)基因的表達而呈現(xiàn)出高度遺傳性，而生活方式、年齡等對 Lp(a)水平影響甚微。所以降低 apo(a)的合成是目前下調血漿中 Lp(a)的主要策略。有一些研究發(fā)現(xiàn)激活膽汁酸受體(法尼醇X受體，F(xiàn)XR)后可以通過與L

3、PA啟動子上正向重復元件1中的-826和-814之間區(qū)域的調控元件DR-1位點相結合，并可以發(fā)揮抑制LPA基因轉錄的作用，從而起到抑制Lp(a)表達的作用。肝細胞核轉錄因子4α（HNF4α）也可競爭性地結合到LPA基因啟動子的該區(qū)域發(fā)揮促進LPA基因轉錄的作用，而HNF4α與FXR結合到LPA基因啟動子DR-1位點的平衡失調，也可能是引起apo(a)表達水平改變的一個原因。早期的研究已經(jīng)證實硫化氫（H2S）具有廣泛的生物學效應如參與了體

4、內的糖脂代謝、細胞的增殖與凋亡及血管新生等的調節(jié)。而現(xiàn)在，越來越多的研究人員在關注H2S對AS的調節(jié)作用，然而迄今為止，許多的研究結果表明H2S發(fā)揮抗AS的機制包括H2S可通過抑制血管平滑肌細胞的增殖、內皮細胞分泌粘附分子表達及同型半胱氨酸誘導的血管損傷等，其中蛋白激酶Cα(PKCα)和蛋白激酶B（AKT）通路是H2S調控糖脂代謝的兩條較為經(jīng)典的信號通路，最近有研究證明PKCα和AKT可分別通過激活FXR及HNF4α而在HepG2細胞中

5、起調節(jié)作用，而FXR和HNF4α也是調節(jié)血漿中脂蛋白(a)水平的較為常見的信號分子，故H2S存在下調apo(a)表達的分子作用潛質?；诖?，本課題旨在探究H2S對HepG2細胞apo(a)表達的影響及其機制研究，為研究下調Lp(a)特異型藥物提供新的靶標和方向。
　　第一部分：H2S對HepG2細胞apo(a)表達的影響
　?。勰康模萦^察H2S對HepG2細胞apo(a)表達的影響。［實驗方法］用含10％胎牛血清的高糖培養(yǎng)基

6、培養(yǎng)HepG2細胞，待培養(yǎng)瓶中的細胞生長至70%左右時，再換含有不同濃度硫氫化鈉（Sodium hydrosulfide，NaHS）（0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）的新鮮無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；及用200μmol/L NaHS處理不同時間（0、6h、12h、24h）；用蛋白質免疫印跡法（Western blot，WB）檢測 apo(a)的蛋白表達水平，用 RT-PCR的方法檢

7、測 apo(a) mRNA表達，ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中apo(a)分泌水平。［結果］與對照組相比，隨著NaHS濃度的增加，HepG2細胞內的apo(a)表達水平及 apo(a)分泌水平呈濃度依賴性下降，其中以100μmol/L、200μmol/L降低效果明顯；而與對照組相比，隨著NaHS作用時間的延長，HepG2細胞內的apo(a)表達水平及apo(a)分泌水平呈時間依賴性下降，其中以24h的下降作用最為顯著。［小結］NaHS呈濃

8、度依賴性及時間依賴性降低HepG2細胞中apo(a)蛋白和mRNA的表達及其分泌水平。
　　第二部分：H2S調控HepG2細胞apo(a)表達的機制
　?。勰康模萏接慔2S影響HepG2細胞apo(a)表達的分子機制。［實驗方法］用無血清高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細胞，分別用FXR siRNA，HNF4αsiRNA，PKCα特異性抑制劑Calphostin C，AKT特異性抑制劑LY294002對細胞進行預處理，隨后加入200

9、μmol/L NaHS處理細胞24h。用Western blot法檢測HepG2細胞中FXR、HNF4α、PKCα、M-PKCα、AKT、p-AKT及apo(a)表達，同時運用RT-PCR的方法檢測細胞中 apo(a) mRNA的表達變化，ELISA法測定細胞培養(yǎng)基中apo(a)分泌水平變化。［結果］H2S顯著上調FXR、M-PKCα及p-AKT表達，而下調HNF4α表達；抑制PKCα及AKT激活可以反轉H2S對HepG2細胞中apo(

10、a)蛋白表達的抑制作用；干擾FXR也可起到相同的效果；而干擾HNF4α后，由于HNF4α干擾后其上游的因子可能通過調節(jié)其他因子，或是其競爭性抑制物 FXR反應性增加從而使apo(a)增加不明顯。［小結］H2S通過PKCα-FXR和Akt-HNF4α通路協(xié)同下調 HepG2細胞中 apo(a)表達。［結論］1.H2S時間及劑量依賴性抑制apo(a)表達；2.H2S通過PKCα上調FXR抑制apo（a）表達；3.H2S通過AKT下調HNF4