1、目的：惡性增殖和轉移是腫瘤細胞的最主要特征。本項目研究Sine oculis homeobox homolog1（SIX1）對于宮頸癌細胞增殖和腫瘤轉移的促進作用及其機制。
　　方法：real-time RT-PCR檢測基因的表達水平。蛋白印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和免疫組化檢測基因的蛋白水平。單熒光流式細胞術檢測表面分子的蛋白水平。免疫組化分析體內淋巴管密度。采用Bioconductor edgeR、Onto-Tool

2、s以及Gene set enrichment analysis軟件包對The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫來源的人宮頸癌測序數(shù)據(jù)進行生物信息學分析。流式細胞術檢測細胞在不同細胞周期中所占的比例。Cell Counting kit-8和軟瓊脂集落實驗用來分析腫瘤細胞的體外增殖。Transwell實驗分析腫瘤細胞的體外遷移和侵襲能力。粘附實驗分析細胞與細胞外基質（ECM）的體外粘附能力。明膠酶譜檢測細胞分泌活性M

3、MP2和MMP9的水平。流式細胞術檢測檢測腫瘤細胞的失巢凋亡。人淋巴管內皮細胞（HLECs）的遷移和成管實驗分析SIX1對體外淋巴管生成的作用。宮頸癌原位移植模型和爪墊模型檢測腫瘤細胞的體內淋巴結轉移能力。實驗性轉移模型檢測腫瘤細胞的對靶器官的粘附、滲出和形成轉移灶的能力?；铙w生物發(fā)光成像以及熒光成像檢測腫瘤的生長和轉移。免疫沉淀研究蛋白質之間的相互作用。染色質免疫沉淀檢測蛋白質與基因啟動子的結合。
　　結果：（一）在宮頸上皮內瘤

4、變和宮頸癌中，SIX1的表達由人乳頭瘤病毒的E7癌蛋白所誘導。SIX1表達的增高導致與DNA復制有關的多基因表達的上調，包括微小染色體維持蛋白復合體（MCM2、MCM3、MCM6），DNA聚合酶α-引物酶復合體（POLA1、PRIM1、PRIM2），clamp loader(RFC3, RFC4, RFC5)，DNA聚合酶δ復合體（POLD3）以及DNA聚合酶ε復合體（POLE2）。與此相一致，SIX1的高表達促進G1至S期細胞周期進程

5、，并促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤的生長。相應的，沉默SIX1可以減慢G1至S期細胞周期進程，并抑制腫瘤細胞的增殖和腫瘤的生長。重要的是，SIX1可以更有效地促進錨定非依賴的細胞生長，從而可能在腫瘤的侵襲浸潤生長和轉移灶中腫瘤細胞的生長起到顯著的促進作用。（二）組織標本免疫組化顯示，宮頸癌的淋巴管生成和淋巴結轉移與腫瘤細胞高表達SIX1密切相關。SIX1的高表達在體內、體外都是通過增強VEGF-C的表達從而增強腫瘤細胞對淋巴管生成的促進作用。

6、SIX1增強TGF-β誘導的SMAD2和SMAD3的激活，并且與SMAD通路協(xié)同促進VEGF-C的表達。SIX1與TGF-β協(xié)同促進腫瘤細胞表達VEGF-C的效應遠遠高于兩者單獨的作用。盡管TGF-β能促進VEGF-C表達，但是TGF-β1通過直接抑制淋巴管內皮細胞的成管，從而抑制淋巴管生成。然而，TGF-β1與SIX1協(xié)同促進的VEGF-C表達不僅直接促進淋巴管內皮細胞的遷移和成管，而且抵抗了TGF-β1對淋巴管內皮細胞的抑制效應。（

7、三）SIX1促進α5和β1亞基的表達，而不調控其他與多種腫瘤預后相關的整合素的表達。SIX1通過上調α5β1表達從而促進腫瘤細胞的體外粘附和體內循環(huán)系統(tǒng)中細胞滯留的能力。通過上調α5β1的表達，SIX1也增強了ECM-α5β1介導的基因表達調控，包括提高活性MMP2和MMP9的分泌、上調抗凋亡基因（BCL-XL和BCL2）、下調促凋亡基因（BIM和BAX），從而增強宮頸癌細胞的轉移能力。阻斷α5β1，可消除SIX1對這些基因的表達調控，

8、也消除了SIX1對腫瘤細胞侵襲能力的促進作用。并且，沉默α5也消除了SIX1在實驗性轉移和自發(fā)性轉移模型中對發(fā)展轉移灶的促進作用。
　　結論：SIX1在DNA復制中起到主調控因子的作用，促進腫瘤細胞的增殖。SIX1通過與TGF-β通路協(xié)同促進VEGF-C的表達，從而促進淋巴管生成和淋巴結轉移。同時，SIX1通過上調α5β1的表達，增強宮頸癌細胞的侵襲、轉移能力。這些發(fā)現(xiàn)說明SIX1在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉移中起關鍵作用。這也提