1、[目的]MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約18-24nt的小分子非編碼RNA，對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，通過(guò)調(diào)節(jié)其作用基因的表達(dá)水平參與多種生理、病理過(guò)程。近幾年的研究表明，一些miRNA與人類腫瘤密切相關(guān)，直接或間接調(diào)控腫瘤的增殖和遷移過(guò)程。本研究應(yīng)用Real-timePCR技術(shù)驗(yàn)證了在宮頸癌組織中miR-20a表達(dá)水平發(fā)生明顯上調(diào)，然后研究了miR-20a對(duì)幾種宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)表型的影響，進(jìn)一步確定了miR-20a，的調(diào)控基因

2、，從而闡明miR-20a對(duì)宮頸癌遷移和侵襲可能發(fā)揮作用的分子機(jī)制。
　　[方法]首先應(yīng)用Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)。miR-20a在人宮頸癌組織和癌旁正常組織中的差異表達(dá)，然后在兩種人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和C-33A細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-20a或封閉miR-20a，利用MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性的變化，并利用遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移性和侵襲性的變化。之后綜合利用生物信息學(xué)方法篩選出miR-20a的候選靶基

3、因TNKS2，并利用熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-20a對(duì)其靶基因的直接調(diào)控作用。通過(guò)Real-timePCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞中內(nèi)源性靶基因mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-20a對(duì)靶基因的調(diào)控作用。最后利用RNA干擾技術(shù)將靶基因的表達(dá)沉默后，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性的變化，并利用遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移性和侵襲性的變化，并應(yīng)用Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)TNKS2

4、在人宮頸癌組織和癌旁正常組織中的差異表達(dá)進(jìn)一步研究靶基因的功能及和miR-20a的相關(guān)性。
　　[結(jié)果]Real-timePCR結(jié)果顯示，miR-20a在人宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。在兩種宮頸癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-20a增強(qiáng)其功能后，細(xì)胞短期增殖能力沒(méi)有發(fā)生變化，但是集落形成能力明顯升高，細(xì)胞的遷移和侵襲能力都明顯升高。當(dāng)封閉miR-20a后細(xì)胞的集落形成能力明顯升高，細(xì)胞遷移和侵襲能力都明顯下降。通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)

5、靶基因篩選結(jié)果表明，端錨聚合酶(tankyrase2，TNKS2)為miR-20a候選靶基因，其3’-非翻譯區(qū)(3’untranslatedregion，3’UTR)包含miR-20a的潛在結(jié)合位點(diǎn)。熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)表明，miR-20a能夠通過(guò)作用于TNKS2基因的3’非翻譯區(qū)的特定位點(diǎn)，對(duì)其表達(dá)進(jìn)行正向調(diào)節(jié)。而在miR-20a過(guò)表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中，TNKS2基因的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平都有明顯升高，封閉則降低，而且在宮頸癌組織

6、中TNKS2基因的mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。將TNKS2基因沉默以后，細(xì)胞增殖未受到明顯影響，細(xì)胞集落形成能力則明顯降低，細(xì)胞的遷移和侵襲能力都明顯降低。
　　[結(jié)論]miR-20a能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲性并增強(qiáng)細(xì)胞長(zhǎng)期的增殖能力，起到癌基因的作用。而且通過(guò)熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)又顯示miR-20a與TNKS2的直接正性調(diào)控作用。在宮頸癌細(xì)胞中，miR-20a對(duì)細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力、遷移和侵襲能力有很大的影響，使TNK